小麦TaGAPC1基因植物过表达载体的构建及拟南芥的遗传转化

来源 :西北农林科技大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:hhtui
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作为世界上主要粮食作物之一小麦在生活的各个方面供给着人类。因此,其品质与产量成为研究者们关注的焦点。GAPC基因在植物逆境胁迫中有着重要作用,为深入了解小麦TaGAPC1基因的功能和抗逆机制,本实验利用以晋麦47的cDNA为模板克隆出目的基因连接到pMD19-T载体上,并对序列进行生物信息学分析,通过同源重组的方法构建过表达载体CaMV35S::TaGAPC1,将含有过表达载体的农杆菌通过花序侵染法侵染拟南芥,通过确定潮霉素的筛选浓度,筛选T2代种子,试验结果如下:1、根据小麦TaGAPC1的全长CDS全长序列,利用DNAMAN和Premier 5.0软件设计引物扩增出目的基因。将其连接到pMD19-T并测序成功,经序列分析得出TaGAPC1定位于7D染色体上的67.28 Mb处,ORF长度为1014 bp,有两个跨膜结构域分别对应的氨基酸位置为(165-185)和(200-219)。2、利用同源重组的方法,成功构建CaMV35S::TaGAPC1植物表达载体并导入到大肠杆菌,并测序成功。3、成功探索出适用于待转化拟南芥的种植条件:初期为短日照8/16 h进行营养生长即莲座生长,长日照16/8 h进行生殖生长即抽薹开花,移栽初期为促进根的生长持续浇灌营养液。待花茎长至3-5 cm,去除顶端花序,待花径约为1.5 mm、花序高约10 cm、主茎上有部分结荚、次级花序处于始花状态,且有大量未开的花序时为最佳侵染状态。4、采用农杆菌介导的花序侵染法将CaMV35S::TaGAPC1表达载体转入拟南芥,侵染的最佳条件为:当含有过表达载体的农杆菌菌液的OD600为1.6-2.0,农杆菌重悬液OD600为0.8左右,侵染时的最佳时间为10 s左右,暗处培养24 h,一周后重复上述侵染步骤。5、确定25 mg/ml为最佳潮霉素筛选浓度,通过筛选成功获得拟南芥T1代13株,并且已收获T2代种子。
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