【染色体3p21鼻咽癌易感基因区全部288个已知基因在鼻咽癌和正常鼻咽上皮中的表达分析】 由于鼻咽癌是一种多基因复杂疾病，其发病受基因和某些环境因素共作用，基因型一表型间关系错综复杂，存在着极高的异质性，和外显不全、拟表型等情况，因而简单套用单基因遗传病模式，从基因型着手采用大规模测序寻找致病突变，从而确定致病基因的思路难以奏效。我们采用从表型着手的方式，利用基因芯片技术对位于该区域的所有基因在较大样本鼻咽癌和正常鼻咽上皮组织中进行较系统的表达谱分析。 首先，我们经PCR扩增，割胶纯化，测序鉴定，克隆了该染色体区域所有288个已知基因的代表性特征序列，点制了包含288个目的基因、阴性对照16点、阳性对照96点及空白对照16点等的定制基因芯片，每点均进行两次重复点样。 然后我们选取7例意外死亡捐献者正常鼻咽上皮，3例鼻咽慢性炎证上皮和23例鼻咽癌活检标本，经显微切割获取纯净的鼻咽上皮和鼻咽癌细胞，抽提高质量mRNA，逆转录，线形扩增，得到这33例标本的待测aRNA样品。同时我们抽提了MCF7，Hela，Raji，HNE1，MG-63和U251等6株不同来源的细胞系mRNA经同样的逆转录和线性扩增，并将它们的aRNA等量混合作为共同对照。将各正常鼻咽上皮或鼻咽癌标本的aRNA用cy5荧光标记，分别与标记cy3荧光的对照样品加到基因芯片上进行杂交。杂交后的芯片经扫描、归一化及统计分析等数据处理。为了保证结果的可靠性，我们另外随机挑选一鼻咽癌的aRNA进行重复杂交。 为了筛选3p21段鼻咽癌表达差异基因，对3p21区域同一基因的两个克隆的信号值求均数，然后每个基因的10个正常和24个肿瘤样本信号值分别求取平均值，正常和肿瘤样本平均值进行比较，以两倍差异在p＜0.05水平为标准，进行T-test统计学检验，结果表明，在3p21区域288个基因中，在鼻咽癌中表达下调的基因主要为乳铁转蛋白Lactotransferrin(LTF)，dystroglycan1，FLJ34969，和TU3A基因，而glutamatereceptor,metabotropic2(GRM2)和interleukin17receptorB在鼻咽癌中存在表达上调。 【鼻咽癌全基因组表达谱分析】通过染色体3p21区域表达谱分析，得到了一些有益的信息，LTF和TU3A基因，尤其是LTF可能是鼻咽癌的易感基因候选子，它可能与鼻咽癌的侵袭转移和临床进展有关，可作为鼻咽癌侵袭、转移和临床进展预测的分子靶标。但基因芯片高通量的优势还没有得到充分发挥，同时较大样本鼻咽癌全基因组表达谱结果尚少见报道。为了充分利用遗传资源，我们另外选用了上海博芯公司8464点包含7945个人类已知基因的高密度基因芯片，在同一玻璃片基上构建了上述显微切割，线性扩增的34例样本(1个重复样本)的全基因组表达谱。 非监督层集聚类分析结果表明正常或慢性炎证组织和肿瘤组织能很清晰的分为两类，T01_F和T01S作为两重复样本聚在一起，N8，N9和N10样本因均为鼻咽慢性炎证上皮，聚为一小束，再与其他正常鼻咽上皮聚类。但肿瘤组织各临床分期没明显的规律。 为了寻找鼻咽癌的分子标志物，我们利用监督聚类方法筛选到的100个鼻咽癌差异表达基因，然后使用WeightedVoting算法最终筛选到6个基因，包括鼻咽癌上调基因RB1，STMN1，DSP和下调基因SERPINB6，AGTRL1和SYTL2。其6个基因代表的分类预测模型能将鼻咽癌和鼻咽慢性炎症上皮很好的区分开来(33/34，97.1％的正确率，Fishersexacttest，p-value=8.389×10-8)。表明这6个基因的表达可代表鼻咽癌的表达特征，其生物学意义值得进一步深入研究。利用RT-PCR方法对SERPINB6和AGTRL1基因进行验证，证实microarray结果可靠。 通过构建GeneMAPP数据表，MAPPfinder寻找基因表达的分子趋势，发现在Biologicalprocess中，细胞增殖，细胞的生长与维持，细胞周期等过程在表达数据中成分比率较大，P均＜0.05。细胞成分(Cellularcomponent)中，膜上和染色体上的分子占的成分多，P均＜0.05。 为了寻找鼻咽癌发生发展相关的信号传导通路，利用统计学T-test方法对24个鼻咽癌(1个重复样本)和10个正常和慢性炎症组织在p＜0.001水平进行分类预测。共筛选到503个cDNA序列，对503个p＜0.001水平的鼻咽癌差异表达的cDNA进行层积聚类。结果表明正常，慢性炎证组织和肿瘤组织很清晰的分为两类，T20为放疗后的鼻咽癌样本，与正常样本聚在一起，T01F和T01S作为重复样本聚在一起，T23，T26和T27样本为非角化鼻咽癌的未分化亚型，聚在一起成一小束，再与其他鼻咽癌标本聚在一起，但肿瘤组织各临床分期没有明显的规律。基因自动成为清晰的两束：一束为鼻咽癌中下调的基因，其中包括PLUNC，丝氨酸/苏氨酸的抑制子SERPINA3，SERPING1，SPLI及与EBV相关的基因PIGR等基因；一束为鼻咽癌中上调的基因，主要包括一些参与细胞周期调控，影响细胞周期的基因。结果与非监督聚类相比，监督聚类的结果更能代表鼻咽癌的主要分子特征。 将T-test方法筛选到的p＜0.001水平的差异基因进行DAVID软件在线分析，发现503个基因中，15个参与细胞周期的基因在鼻咽癌中表达失常，这说明细胞增殖和细胞周期失控是鼻咽癌的普遍现象。另外，FZD7，CSNK2B，cyclinD2，DAAM2，SIP，CBP和BTRC等7个分子属于WNT通路，这说明该通路可能在鼻咽癌中表达失调；CDC42EP3，GPS1，MAP3K2，MAPK12，MGC3794，NFKB1，RAC1，TAB1，TRAF2和STMN1等基因属于MAPK通路；CREB，SMAD2，TGFBR2和DP-1等基因属于TGF-β通路；MAML1和HDAC2属于NOTCH通路。且各通路之间存在crosstalk，如CBP蛋白是TGF-β通路上的一分子，但它又影响WNT通路。 大量证据表明WNT通路在许多肿瘤中如结肠癌，头颈部肿瘤，黑色素瘤，白血病等中活化。Sriuranpongeta1.通过microarray分析提示WNT通路可能在鼻咽癌中活化，但缺乏进一步详细的证据证实。为了阐明WNT通路在鼻咽癌中的作用，我们构建了组织微阵列，大量的临床样本检测microarray研究中筛选到一些WNT通路的分子在鼻咽癌中的表达情况。原位杂交检测结果表明FZD7，DAAM2和WNT5A基因在肿瘤细胞中呈阳性，阳性表达部位主要在细胞浆和细胞核。FZD7，DAAM2和WNT5A基因在鼻咽癌，鼻咽癌癌旁和鼻咽慢性炎症标本中存在表达差异，FZD7，DAAM2和WNT5A基因在鼻咽癌中的阳性表达率均明显高于癌旁上皮和鼻咽慢性炎症上皮(p＜0.05)。但各临床分期和肿瘤分型间表达未见统计学意义。 免疫组化检测显示鼻咽癌组织中p300/CBP，CaseinkianseⅡβ和WNT5A基因均存在高表达，其阳性率显著均高于癌旁上皮和慢性炎症上皮(p＜0.05)。β-catenin在鼻咽癌中存在91of387(23.51％)的核阳性，而在癌旁上皮和炎症上皮中β-catenin主要表达在胞膜，在胞浆中弱表达，不存在β-catenin的核阳性。利用SPSS软件的Spearman方法对WNT5A蛋白水平的表达与mRNA水平进行相关性分析，发现二者的表达存在明显的相关性，p＜0.01，r=0.423，说明鼻咽癌中WNT5A在蛋白和mRNA水平均存在过表达。 为了检测EBV在鼻咽癌中的作用，我们利用原位杂交方法检测EBER基因在鼻咽癌组织微阵列中的表达，统计结果显示EBER基因在鼻咽癌中的阳性表达率均明显高于癌旁上皮和鼻咽慢性炎症上皮(p＜0.05)，利用SPSS软件分析发现FZD7，CBP和CaseinkinaseⅡβ的表达与EBER的表达在鼻咽癌存在明显的相关性，p＜0.05，提示它们可能与EBV感染在鼻咽癌的发生发展中有密切关系，其相互作用机制值得我们进一步研究。综上所述，本文通过鼻咽癌和正常鼻咽组织间的基因表达谱的构建，数据分析，全面系统的分析了3p21区域288个已知基因在鼻咽癌中的表达情况，得到了Lactotransferrin，TU3A，dystroglycan1，FLJ34969，GRM2和IL17RB等6个表达鼻咽癌候选易感基因，为下一步通过突变检测，功能分析等鉴定鼻咽癌的易感基因奠定基础。 结合基因表达谱的信息，我们筛选到了RB1，STMN1，DSP1，SERPINB6，AGTRL1和SYTL2等6个基因可能是鼻咽癌表达的候选分子标志物。利用组织微阵列首次发现WNT通路中FZD7，DAAM2，WNT5A，β-catenin，CBP和CaseinkinaseⅡβ等在鼻咽癌表达上调。WNT通路成员的活化说明WNT通路在鼻咽癌中可能起重要的作用。