研究的背景与目的：人胚胎干细胞在体外培养与扩增的条件十分苛刻，其中饲养层是至关重要的因素之一。目前研究者普遍采用小鼠来源的成纤维细胞作为饲养层，以支持人胚胎干细胞的体外分化抑制培养，但小鼠与人的种属差异甚大，利用鼠源性饲养层很有可能会带来某些病原微生物或异种蛋白污染，从而给临床应用带来潜在的风险。本研究旨在探讨利用人胚胎成纤维细胞代替小鼠成纤维细胞支持人胚胎干细胞的体外分化抑制培养，为临床应用打下基础。 国家教育部重点资助项目 重庆医科大学攻关课题<WP=7>方法：分离、培养、纯化原代人胚胎皮肤成纤维细胞(human embryonic dermal fibroblasts, hEDFs)，经反复传代培养以获得能在体外长期生存的hEDFs。hEDFs的鉴定：①光镜和电镜观察其形态；②免疫细胞化学染色检测人成纤维细胞特征性标志—波形蛋白，Ⅳ型胶原蛋白的表达；③碱性磷酸酶(AKP)染色检测AKP的表达；④鸡红细胞吞噬试验检测其有无吞噬功能。用细胞计数法检测不同种植密度下人成纤维细胞克隆性生长的能力，研究其生长特点并绘制生长曲线。经体外长期传代培养、扩增和冷冻复苏后观察其增殖能力和生物学特性的稳定性。用MTT法检测丝裂霉素C对hEDFs生长的影响，筛选抑制有丝分裂的最佳时间和浓度。观察人胚胎生殖细胞(human embryonic germ cells, hEGCs)在制备的hEDFs饲养层上的生长情况。结果：获得了能在体外长期生存的hEDFs。鉴定结果显示该细胞体系具有典型的成纤维细胞形态、功能、免疫细胞化学和酶化学标志等生物学特征。在75ml培养瓶中种植细胞数以2.5×105为佳，第5～17代hEDFs<WP=8>生长旺盛，最适宜hEGCs的培养；经冷冻、复苏后hEDFs生长仍旺盛，该细胞传至32代时仍可以用于hEGCs的培养。终浓度为12.5μg/ml丝裂霉素C处理hEDFs 3小时可完全抑制hEDFs的有丝分裂，处理后的成纤维细胞至少可以在7d内维持良好的生活状态。在hEDFs饲养层上培养hEGCs，细胞增殖并形成EGCs典型集落（详见论文第二部分）。结论：建立了能在体外长期生存的hEDFs体系；用该hEDFs制备的饲养层，配合使用含分化抑制因子的培养基，完全能支持hEGCs在体外存活和增殖并维持未分化状态。