研究目的临床上脑缺血发生后,缺血半暗带形成,再灌注会造成脑组织损伤,其中缺氧和炎症反应尤为突出,临床上患者出现严重的偏身感觉、运动及情感障碍。本论文探索了改良线栓法在脑血流仪的检测下制作大鼠大脑中动脉线栓阻塞脑缺血再灌注损伤模型,并探讨了针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤后大鼠的行为学、神经炎症缺氧反应及神经血管再生的干预机制,从表观和分子生物学角度探索针刺治疗缺血性脑血管病的作用机制。实验方法通过随机数字表法将健康雄性SD大鼠分为假手术组、模型组、针刺组、电针组和药物组。后四组根据再灌注时间又分为1d、3d、5d和7d四个不同时间点,分批次进行实验。以改良线栓法阻塞大鼠右侧大脑中动脉制备脑缺血再灌注损伤模型,并用脑血流仪检测大脑中动脉分布区的血流,在插入线栓后出现70%以上缺血,并维持1.5h后实现再灌注,即为模型成功。模型组：大鼠右侧大脑中动脉阻塞造成脑缺血1.5h后再灌注；针刺组：脑缺血再灌注后24h给予针刺百会和左足三里穴；电针组：在针刺组基础上加用脉冲治疗仪；药物组：每日腹腔注射依达拉奉。各组大鼠根据再灌注时间以Bederson及mNSS分评估大鼠神经功能。再灌注72h后,各组大鼠麻醉后断头取脑,TTC染色后以Image J计算其脑梗死体积。通过抓力试验、转角试验、圆筒试验、糖水偏爱试验、旷场试验来检测大鼠的肢体的肌力、肢体使用偏向、探索能力及情绪改变。应用免疫组织化学(Immunohistochemistry)染色和蛋白质印迹(Western blot)法检测脑缺血大鼠VEGF、Hif-1a、Thorase、GFAP的表达；采用RT-PCR法检测脑缺血大鼠VEGF、 Hif-1a、Thorase、GFAP等基因的mRNAs表达情况。实验结果1. Bederson评分显示：假手术组大鼠的神经功能评分为0,未见任何神经功能损伤；而其他各个造模组在再灌注24h均有相应的神经损伤,随着各组的治疗,针刺组、电针组和药物组的神经功能评分低于模型组；针刺组、电针组、药物组组间比较无统计学差异。 (图1-6)2.TTC染色显示：假手术组大鼠双侧脑组织结构规整,层次分明,呈鲜红色,未见缺血灶；模型组、针刺组、电针组及药物组在大鼠右侧脑组织大脑中动脉供血区域,可见到淡白色的梗死灶,边缘伴有淡红色,且伴随72h的治疗后三组与鲜红色的正常脑组织形成对比。针刺组、电针组和药物组大鼠脑梗死体积低于模型组；针刺组及电针组大鼠脑梗死体积与药物组组间比较无统计学差异。 (图1-7,1-8)3.行为学实验测定显示： (1)mNSS评分显示：假手术组大鼠未见任何神经功能损伤、脑组织无缺血,评分为0；而其他各个造模组在再灌注24h均有相应的神经损伤,治疗后,药物组的神经功能评分在1、3、5、7d四个时间点均低于模型组；电针组在1d和7d明显低于模型组；针刺组、电针组、药物组组间相比无统计学意义。 (图2-5)(2)抓力实验结果显示：假手术组未见任何肌力损伤；模型组、针刺组、电针组及药物组均存在不同程度的肌力损害；电针组和药物组在1、3、5、7d各个时间点的肌力均高于模型组；针刺组除了在1d时与模型组没有差异外,其余3、5、7d三个时间点有差异；后三组组间比较无统计学差异。(图2-6)(3)转角试验显示：假手术组未见明显的肢体使用偏性,侧向指数趋向于0；针刺组和电针组在各个时间点的前肢侧向指数均低于模型组；在3、5、7d,药物组低于模型组；后三组组间比较统计无差异。(图2-7)(4)圆筒试验显示：假手术组无肢体使用不对称性;其余各组均存在不同程度的肢体使用偏性及不对称性,在1、3、5、7d各个时间点,电针组和药物组的肢体使用不对称评分低于模型组；而针刺组的使用不对称性仅在在3d与5d低于模型组,后三组组间未见差异。(图2-8)(5)糖水偏爱实验可见：假手术组大鼠在各个时间点糖水偏向指数均较高；在5d和7d两个时间点上,电针组和药物组的糖水偏爱指数均高于模型组；针刺组与模型组相比无统计学差异；后三组组间见未见统计学差异。(图2-9)(6)旷场实验显示：整体运动路程及平均速度上,各组之间未见统计学差异；在周围场和中心场,各个组在各个时间点的累积停留时间和频率均未见明显差异。 (图2-10)4.神经血管再生相关指标表达(1)免疫组化结果显示：模型组VEGF、Hif-1a、 GFAP及Thorase蛋白整体呈现增高趋势。①VEGF蛋白：针刺组、电针组、药物组随着时间进程该蛋白呈现出先降低后增高的变化趋势,蛋白表达均在7d时呈现高峰。模型组在1、3、5、7d四个时间点均明显高于假手术组；针刺组在1d及7d时间点均高于假手术组；电针组及药物组在1、5、7d三个时间点均高于假手术组；与模型组相比,针刺、电针组在7d明显增高；针刺组在5d时间点上低于模型组；各治疗组间比较,药物组高于针刺组、电针组。(图3-1)②Hif-1a蛋白：模型组蛋白表达在缺血再灌注1d呈现高峰；模型组、针刺组、电针组、药物组在1、3、5、7d均明显高于假手术组；针刺组与药物组在1d、3d和7d低于模型组；电针组在1d及7d明显低于模型组,差异具有统计学意义。 (图3-5)③Thorase蛋白：模型组、针刺组、电针组、药物组均在1d时明显高于假手术组；在5d时,模型组高于假手术组；药物组低于假手术组；针刺组在5d和7d均低于模型组；电针组及药物组在5d及7d明显低于模型组,各治疗组间未见明显差异。 (图3-9)④GFAP蛋白：针刺组在7d高于模型组；电针组在1d和7d明显高于模型组；药物组在3d和7d明显高于模型组；组间比较,药物组在各时间点均低于针刺组；药物组在3d和7d低于电针组。 (图3-13) (2)Western blot结果显示：①VEGF蛋白：与模型组相比,针刺组、电针组、药物组均呈现不同程度的高表达,针刺组在1、3、7d表达量高于模型组；电针组在7d时表达明显高于模型组；后三组组间比较无差异。(图3-2,3)②Hif-1a蛋白：在3d时,针刺组、电针组明显低于模型组;后三组组间比较无差异。(图3-6,7)③Thorase蛋白：与假手术组相比,模型组在3d和7d Thorase蛋白明显高表达；针刺组和电针组在1d和7d的表达高于假手术组；药物组在1、3、7d高于假手术组；与模型组相比,针刺组、电针组、药物组在1d和7d均增高；各治疗组比较,药物组在3d明显高于针刺组；在5d高于电针组；针刺组和电针组间未见明显差异。 (图3-10,11)④GFAP蛋白：与假手术组相比,模型组在1、3、5、7d均明显增高；针刺组和电针组在1、3、5、7d均明显增高；药物组在1、5、7d明显增高；各治疗组间比较,电针组在5d明显低于针刺组,在7d高于针刺组,药物组在3、5、7d均明显低于针刺组；药物组在7d明显低于电针组。(图3-14,15)(3) RT-PCR结果显示：①VEGF mRNA:针刺组、电针组及药物组的基因表达逐渐增高,模型组未见明显变化；其中电针组在3d、5d及7d明显高于模型组；针刺组及药物组仅在7d时高于模型组；各治疗组间比较,药物组在3d明显高于针刺组。 (图3-4)②Hif-1a mRNA:针刺组、电针组、药物组在3d时的基因表达呈现高峰；各治疗组表达与模型组未见明显差异；药物组仅在7d高于模型组；各治疗组间比较,电针组在1d明显低于针刺组；药物组在7d明显高于针刺组、电针组。 (图3-8)③Thorase mRNA针刺组在1、3、5、7d均低于模型组；电针组和药物组仅在7d明显低于模型组。各治疗组间比较,电针组及药物组在1、3、5d明显高于针刺组。(图3-12)④GFAP mRNA:在1、3、5、7d,针刺组和药物组低于模型组；电针组仅在1、3、5d明显低于模型组；各治疗组间相比,仅药物组在5d明显低于电针组。 (图3-16)结论1.脑缺血再灌注损伤72h后,针刺、电针及药物治疗可以挽救坏死的半暗带区域的脑组织。2.大鼠脑缺血再灌注损伤后表现出明显的偏身感觉、运动障碍及情感障碍,针刺、电针及药物治疗可以有效地改善大鼠的神经功能,提高大鼠的肌力及肢体使用偏性,改善大鼠的抑郁情绪。3.大鼠脑缺血再灌注损伤后脑组织中神经血管再生因子VEGF、Hif-1a、 Thorase及GFAP表达均有所上调。针刺、电针及药物治疗能够上调VEGF、GFAP蛋白表达；下调Hif-1a、Thorase蛋白的表达。创新点以经典线栓法制备大鼠MCAO模型,并采用激光多普勒血流仪检测MCA区域的脑血流的改变,进一步验证模型成功。通过检测大鼠的神经功能及行为学,直观的验证了针刺的有效性；并且采用免疫组化、蛋白印迹、RT-PCR法分别从蛋白及基因水平检测脑组织中VEGF、Hif-1a、Thorase、GFAP神经血管再生相关通路上的重要指标的表达,验证针刺百会、足三里穴对脑缺血再灌注损伤大鼠脑组织的相应机制。经文献检索,尚未发现针刺百会和足三里穴同时对大鼠行为学及脑缺血再灌注损伤脑组织中VEGF、Hif-1a、Thorase、GFAP的干预机制的研究。