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本文主要从以下几个方面进行论述： 课题一:原发性血小板减少症中由异常脂筏介导的T淋巴细胞信号传导相关研究 原发免疫性血小板减少症（primary immune thrombocytopenia，ITP）是一类由于自身免疫导致的血小板破坏增加、血小板生成受损的疾病。由于自身免疫耐受的打破，从而导致针对血小板以及巨核细胞的体液免疫和细胞免疫是慢性ITP的主要发病机制。异常的T淋巴细胞信号通路被认为在ITP的异常免疫状态中起到重要作用，脂筏则被证实参与了T细胞抗原受体(T cell receptor，TCR)介导的信号传导。而与脂筏相关的T淋巴细胞信号转导是否对ITP的发病有作用仍未见报道。 目的:本研究旨在揭示ITP患者CD4+和CD8+T淋巴细胞中脂筏结构和功能是否存在异常。 方法:(1)流式分选出ITP患者及正常对照的CD4+和CD8+T淋巴细胞，使用荧光素标记的霍乱毒素B亚基(cholera toxin B，CTB)染色，霍乱毒素B亚基能特异地结合到脂筏上的神经节苷脂GM1上，用异硫氰酸荧光素与CTB偶联对T细胞进行标记，在共聚焦显微镜下可以观察到细胞膜上的区域化结构及检测出GM1在患者和正常对照T细胞的水平。(2)使用抗CD3/CD28抗体刺激CD4+和CD8+T淋巴细胞并培养48小时，共聚焦显微镜检测活化后T细胞和未活化T细胞平均荧光强度(Median Fluorescence Intensity，MFI)对比。(3)在抗 CD3/CD28抗体活化CD4+和CD8+T淋巴细胞的基础上加入胆固醇去除剂Methyl-β-cyclodextrin(MβCD)，检测 MβCD是否可以抑制TCR介导的脂筏聚集，同时检测未活化组、活化组、活化后加入MβCD阻断组CD4+和CD8+T细胞增殖情况及培养上清中IFN-γ、 TNF-α、IL-10等细胞因子水平。(4)检测同一个患者治疗前和完全缓解后GM1水平，以探讨疾病活动程度和治疗手段对ITP患者CD4+和CD8+T淋巴细胞脂筏聚集的影响。(5)流式分析检测未治疗患者组，治疗后患者组和正常对照组CD4+和CD8+T淋巴细胞中蛋白酪氨酸磷酸酶(Protein Tyrosine Phosphatase，PTP) CD45及CTB的共定位双阳性细胞所占比例，使用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)和离子霉素(ionomycin)刺激各组T淋巴细胞后检测CD45+及CTB双阳性细胞比例变化。 结果:(1)相较于正常对照，ITP患者脂筏聚集程度明显增加。(2)使用抗CD3/CD28抗体刺激后，ITP患者CD4+和CD8+T淋巴细胞脂筏的聚集进一步增加，且聚集程度高于正常对照活化后T淋巴细胞。(3) MβCD可以阻断CD4+和CD8+T淋巴细胞脂筏的异常聚集，以及由TCR介导的T淋巴细胞的增殖及细胞因子的分泌。(4) ITP患者CD4+和CD8+T淋巴细胞脂筏聚集不受疾病活动程度及治疗手段的影响。(5) ITP患者体内T淋巴细胞的活化水平升高可能与CD45和脂筏共定位的上调有关。 结论:ITP患者CD4+和CD8+T淋巴细胞中存在脂筏异常聚集以及脂筏相关的信号转导分子的改变。这种异常是基于ITP患者体内T淋巴细胞的自身活化以及对外来刺激应答阈值的降低。在体外实验中，ITP患者T淋巴细胞的异常可以被MβCD所纠正。我们的研究揭示了脂筏结构和功能的异常可能在ITP的发病机制中发挥重要作用。 课题二:慢性免疫性血小板减少症患者中IP-10和MCP-1基因多态性与疾病易感性的相关研究 原发免疫性血小板减少症(primary immune thrombocytopenia，ITP)是一类由于自身免疫导致的血小板破坏增加、血小板生成受损的疾病。由于自身免疫耐受的打破，从而导致针对血小板以及巨核细胞的体液免疫和细胞免疫是慢性ITP的主要发病机制。研究证实，外周血异常的Th1细胞和Th2细胞极化在ITP异常免疫状态中发挥至关重要的作用，而慢性ITP患者体内存在Th1免疫细胞的极化。干扰素γ诱导蛋白10（interferon-γinducible protein-10，IP-10），也称为CXCL10，与各种Th1主导的自身免疫性疾病相关。而单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein1，MCP-1)，也称为CCL2，在一些病理状态下能够促进Th2介导的免疫反应。 目的:由于Th1和Th2免疫细胞因子以及趋化因子的释放受由基因的多态性影响，我们设计实验研究IP-10和MCP-1多态性分布与ITP易感性之间的关系。为探讨慢性ITP患者IP-10和MCP-1多态性分布是否存在异常提供实验基础及理论依据，亦为慢性ITP的发病机制研究探讨新思路。 方法:病例对照研究。我们通过聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(RestrictionFragment Length Polymorphism，RFLP)的方法，研究了235例慢性ITP患者和162例正常对照中IP-10基因(-201G/A)位点和MCP-1基因(-2518A/G)位点多态性。 结果:IP-10基因（-201G/A）位点优势等位基因为G，健康对照人群中G、A等位基因频率比94.4％:5.6％。慢性ITP组（-201G/A）位点等位基因A及AG基因型频率分布显著高于正常对照组（P=0.011; P=0.036）;A、AG的优势比(OR)及95％置信区间(95％CI)分别为2.186(1.185～4.031)，2.240(1.149-4.367)。分层分析结果:女性患者组A、AG频率显著高于同性别对照组(P=0.014，P=0.049)，OR(95％CI)分别为2.449(1.178-5.095)，2.413(1.115-5.220)。成人ITP组A、AG频率显著高于正常对照（P=0.004;P=0.017），OR(95％CI)分别为2.429(1.299-4.540)，2.240(1.149-4.367)。MCP-1基因(-2518A/G)位点的基因型以及等位基因则在ITP患者和正常对照之间未见显著差异，而且按照发病年龄以及性别进行分层分析亦得出类似结果。 结论:研究证实IP-10基因(-201 G/A)多态性和ITP遗传易感性相关，A为ITP患病的风险等位基因，并且患病风险的高低和A等位基因携带率呈剂量依赖关系;-201G/A在各组ITP中起到的作用可能不同，我们的结果提示女性人群IP-10基因(-201G/A)中A等位基因的高水平分布可能是ITP在女性总体发病率较高的遗传学基础之一，同时A等位基因的比例升高可能是成人ITP患者易感因素之一;目前至少可以肯定-201G/A是女性ITP、成人ITP风险预测因素。