论文部分内容阅读
SHP-2，一种含有SH2区域的胞浆蛋白酪氨酸磷酸酶，参与了各种生长因子和细胞因子的信号传导过程。其在从细胞表面向胞核的信号传导通路中这种磷酸酶扮演着重要的角色，是细胞增殖和分化的重要调节分子。SHP-2主要作用于细胞因子、抗原、细胞外基质等的下游，通过特异性识别SH2结构域的磷酸化酪氨酸位点与多种R-PTKs(R-protein tyrosine kinase)相互作用。SHP-2对生长因子和细胞因子信号转导有正向调节作用并刺激发育相关路径、阻滞抑制生长的信号转导。SHP-2的第459个氨基酸残基Cys在其发挥酶作用中是一个重要的基团，如用Ser取代Cys可使SHP-2酶活性完全消失，但是这种突变体通过SH2区域与其他信号中间体相结合的能力却没有改变。而且相对于内源性野生型SHP-2来讲主要起负调节的作用。这一突变体可以导致FAK(Focal Adhesion Kinase)去磷酸化和磷酸化循环中断，使迁移过程中的细胞粘附能力增强和移动能力降低。E-钙粘蛋白存在于上皮细胞膜上，是细胞与细胞、细胞与基质间一种重要的钙离子依赖性粘附分子。通过控制细胞移动从而在组织形态发生、胚胎发育和细胞凋亡等过程中发挥作用。基质金属蛋白酶是一种锌依赖蛋白酶系统，其中间质胶原酶MMP-1主要降解间质胶原，即Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型以及Ⅶ、Ⅹ型胶原，不能降解明胶、Ⅳ型胶原等ECM，MM-9(明胶酶B)能降解明胶、基底膜胶原(Ⅳ型胶原)，还降解Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原，但对间质胶原无作用。E-钙粘蛋白和MMP-1、9在细胞移动中均发挥着重要作用，SHP-2促进细胞移动是否与这两种分子有关，目前国内外未见报道。SHP-2不仅具有促进肿瘤转移的作用，同时也对早胚发育和细胞生长中起作用，而且与细胞移动和遗传性疾病也具有相关性。本研究首先成功筛选并建立了三种乳腺癌细胞株即GFP-MCF-7乳腺癌细胞株、野生型SHP-2-GFP-MCF-7乳腺癌细胞株、突变型SHP-2／(C＞S)-GFP-MCF-7乳腺癌细胞株，利用细胞移动实验、细胞粘附实验、免疫沉淀、蛋白印迹等生物学实验方法，从形态学、蛋白表达量、磷酸化水平等方面分析细胞形态变化、E-钙粘蛋白和基质金属蛋白酶MMP-1、9在三种细胞株中的表达情况和细胞因子IL-1第二军医大学硕士论文中文摘要王凤玫刺激后三种细胞株中的表达情况，进而分析SHP一2蛋白酪氛酸磷酸酶促进细胞移动是否与E一钙粘蛋白和基质金属蛋白酶MMP一1、9有关;另一方面我们通过观察不同细胞株的裸鼠致瘤性以及肿瘤细胞的体内转移情况，从而进一步分析SHP一2促进肿瘤转移的作用.结果发现:(l)成功构建了三种乳腺癌细胞株:GFP一MCF一7乳腺癌细胞株、’野生型SHP一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株、突变型SHP一2/(C>S)一GFP一McF一7乳腺癌细胞株。(2)野生型SHP一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中SHP一2蛋白酪氨酸磷酸酶的磷酸化水平增强，而突变型SHP一2/(c>s)一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中SHP一2的磷酸化水平降低。(3)转染了突变型重组质粒的细胞株的形态发生变化，野生型乳腺癌细胞的形态为伸展的、梭形的、高极性的，而突变型乳腺癌细胞株的形态为扁平的、圆形的、细胞之间连接紧密。在GFP一MCF一7组与sHP一2一GFP一McF一7组之间未见有差别。(4)野生型细胞株的细胞移动能力增强，突变型乳腺癌细胞株的细胞移动能力降低。(5)野生型S即一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株的细胞粘附能力降低，而突变型乳腺癌细胞株的细胞粘附能力增强。(6)野生型SHP一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株的伸展性增强，而突变型乳腺癌细胞株的伸展能力降低。(7)在三种乳腺癌细胞株中，野生型51于一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株的E一钙粘蛋白的表达最低，而突变型SHP一2/(C>S)一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株的E一钙粘蛋白的表达最高。(8)与E一钙粘蛋白的表达情况正好相反，基质金属蛋白酶MN田一l、MMP一9在三种乳腺癌细胞株中的表达情况是:野生型S即一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中MMP一1、9的分泌量最高，而在突变型51于一2/(C>S)一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株这两种基质金属蛋白酶的表达量是最低的。(9)细胞因子IL一1刺激后和刺激前观察三种乳腺癌细胞株的E一钙粘蛋白的表达发现在IL一1刺激后的野生型51于一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中E一钙粘蛋白的表达是最低的，几乎检测不到其表达;而在IL一1刺激前的突变型SHP一2/ (C>S)一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中E一钙粘蛋白的表达量在六组中是最高的。(10)同样观察细胞因子IL一1刺激后和刺激前观察三种乳腺癌细胞株的基质金属蛋白酶MMP一9的细胞分泌情况发现，在IL一1刺激后的野生型SHP一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中MMP一9的细胞分第二军医大学硕士论文中文摘要王凤玫泌情况是最高的，而在未经IL一1刺激的突变型SHP一2/(C>S)一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株中MMP一9的表达情况在六组中是最低的。(1l)注射了三种乳腺癌细胞株的裸鼠中均有肿瘤生长的现象，但是只在注射了野生型51于一2一GFP一MCF一7乳腺癌细胞株的裸鼠组的肺脏、肾脏中有肿瘤转移的情况