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H5N1亚型高致病性禽流感病毒在全世界广泛传播,给家禽养殖业造成重大损失。除严重危害家禽养殖业外,H5N1禽流感病毒还感染人。自1997年香港首次发现人感染高致病性H5N1病毒至今,全球已经报道的H5N1感染人病例784例,其中429例死亡,死亡率达55%。持续发生的人感染H5N1病例,成为严重威胁人民生命健康的公共卫生事件。研究揭示H5N1禽流感病毒哺乳动物致病的分子基础,对预防和控制H5N1传播有重要意义。本论文以H5N1亚型禽流感病毒禽分离株A/chicken/Hubei/489/2004 (H5N1)(HB04)和A/duck/Hunan/316/2005 (H5N1) (HN05)为研究对象,在细胞和机体水平研究了两株病毒的生物学特性和致病性,取得了以下研究成果：1.研究了两株H5N1禽流感病毒禽分离株对禽和小鼠的致病性。HB04和HN05都是高致病性禽流感病毒,鸡的静脉注射毒力指数(IVPI)分别为2.4和1.4。HB04是小鼠低致病性毒株,MLD50为105.4TCID50, HB04感染小鼠在肺组织不能复制,感染后肺病毒滴度逐渐降低,在感染后第5天不能检测出病毒；HN05是小鼠高致病性毒株,MLD50为102.5TCID50,能在小鼠肺组织中复制,感染后第3天肺组织病毒滴度达到峰值105.5TCID50/100mg。在哺乳动物细胞上,HN05有更高的复制效率,而在禽类细胞上,两株病毒的复制没有显著差异。2.分析了HB04和HN05两株病毒的核糖核蛋白复合物(RNP)活性。结果表明,在293T细胞上,HN05的RNP活性是HB04的10337倍。以HB04 RNP为背景进行单基因替换结果表明,当HB04的PB2基因被HN05的对应基因替换时,RNP活性增加102.05倍,而PBK、PA和NP替换对RNP活性影响较小(分别提高100.70、100.05和100.58倍)。3.构建了HB04和HN05的8质粒反向遗传操作系统。采用基因重配构建一系列基因替换的重组病毒,研究了重组病毒的小鼠致病性。结果表明,聚合酶亚单位PB1、PA基因对重组病毒的致病性影响最大,rHB/HN-PB1和rHB/HN-PA的MLD5o与rHB04相比分别提高了102.3、101.6倍。rHB/HN-PB1和rHB/HN-PA感染在小鼠肺组织造成更严重的病理损伤。我们同时测定了重组病毒在小鼠肺组织的复制特性。与rHB04相比,rHB/HN-PB2在小鼠肺组织复制效率显著提高,而rHB/HN-PB1和]rHB/HN-PA在小鼠肺组织的复制效率提高幅度较小。4.将小鼠低致病性的HB04毒株在小鼠肺组织连续传代,得到小鼠适应株HB04M。研究证实,HB04M对小鼠的毒力显著增强,MLD5o为10-0.4TCID50,感染小鼠的平均生存时间(MST)为5.6天；对禽的致病性有轻微改变,IVPI为1.9,仍为禽高致病性毒株。HB04M感染小鼠后第1天,肺组织病毒滴度达到105.6TCID50/100mg,并一直维持高滴度。HB04M在哺乳动物细胞上增殖更快；而在禽类细胞上,HB04M与HB04的复制特性没有显著差异。5.构建了HB04M毒株的8质粒反向遗传操作系统。基因组测序分析发现,小鼠传代适应株病毒基因组中包含23个氨基酸残基突变,除已知与哺乳动物致病性相关的PB2 E627K突变外,其他突变位点均未被报道。对HB04M的PB2进行K627E回复突变,重组病毒的MLD5o为102.9TCID50,介于HB04的105.4TCID50和HB04M的10-0.4TCID50之间,说明HB04M基因组上的其它突变影响病毒对小鼠的毒力。以HB04为背景替换HB04M单基因构建了重组病毒,并测定其对小鼠的致病性。结果表明：HB04M的聚合酶基因显著增强重组病毒的小鼠毒力。rHB/M-PA的MLDso为101.8TCID50,小鼠的MST为6.6天。rHB/M-PB2和rHB/M-PB1的MLDso分别为102.6、102.8TCID50。以HB04M为背景构建的重组病毒的致病性分析也得到相同的结论。6.点突变分析发现,PB2 E627K、PB1 I205V和PA V474A是决定HB04M对小鼠高毒力的关键位点。这三个位点同时突变得到的重组病毒的小鼠毒力与HB04M相近。我们的研究结果对于理解H5N1禽流感病毒的哺乳动物致病性和跨物种传播机制有重要意义。