1.目的　　肺癌是肺部最常见的恶性肿瘤。根据世界卫生组织的调查报告，许多国家和地区肺癌的发病率均占恶性肿瘤的首位。且男性多于女性，男女之比约为4-8∶1。近十年来中国肺癌发病率持续增高，环境因素被认为是影响肺癌发病最重要的因素，主要包括吸烟、大气污染等。如吸烟者肺癌发病率是不吸烟者的10-40倍。然而，吸烟者90％不会发展成肺癌，吸烟者不同家族和地域中发生肺癌的几率也并不相同，提示个体的遗传因素在肺癌的发生和发展中也起着重要的作用。越来越多的研究表明肺癌是环境与个体基因相互作用引起的，致癌物代谢、DNA修复和细胞增殖与凋亡控制基因的遗传变异等，都可能是与吸烟有关的肺癌的重要遗传易感因素。近年来，全基因组关联研究(GWAS)提示人类基因组上某些单核苷酸多态性(SNP)位点与肺癌易感性存在非常密切的关系，如染色体5p15.33位置CLPTM1L基因内含子区域的rs401681和15q25上AGPHD1基因内含子区域的rs8034191等。然而，由于人群种族、环境的不同，中国与西方国家基因组中SNP位点存在很大的差异。已有文献报道西方人群与肺癌相关的SNP位点在中国人群中不一定适用，因此在后GWAS时期，在中国人群中对这些易感位点进行重复研究和验证就显得非常重要。本研究主要采用高分辨率溶解曲线（high-resolutionmeltinganalysis，HRMA）这一高效、敏感与快速的方法在中国河南地区肺癌患者中检测某些特定SNP位点与肺癌发生的相关性，旨在确定这些在欧洲人群中发现的肺癌易感性位点是否也与中国人群肺癌发生密切相关。　　2.资料与方法　　2.1肺癌患者与样本采集　　收集2008年1月至2011年5月郑州大学附属肿瘤医院手术切除的肺癌组织（含癌旁组织）石蜡标本492例，其中病理诊断为非小细胞肺癌393例、小细胞肺癌99例。组织标本中男性380例，女性112例，年龄22～79岁。同时采用河南省人民医院体检的无症状人群提取上肢外周血486例作为健康对照。　　2.2基因组DNA提取　　石蜡组织块中癌旁组织基因组DNA的提取主要使用美国Qiagen公司的AllprepDNA/RNAFFPE试剂盒(Qiagen，Gaithersburg,MA，USA)，严格按照使用手册操作。正常人外周血使用广东Innogent公司的基因组DNA抽提试剂盒(InnogentgenomicDNAextractionkit)提取，严格按照使用手册操作。　　2.3高分辨率溶解曲线分析法（非标记探针法）　　2.3.1使用非标记探针法的不对称PCR反应体系　　使用Primer3软件(http://frodo.wi.mit.edu/primer3)设计rs8034191扩增引物Foward:5-AGCTACAGCGTCATCAAAGTG-3,Reverse:5-TTCCCCTGATTTCCACAAG-3（产物片段长度131bp）;设计针对rs8034191野生型序列的探针（长度25bp）:5-AAGTTTTCTGTTTAGAAAGGCCCTG-3(C3-blocked)。rs401681的扩增引物forward:5-AGAAAACAAGGTCTGCTATCCA-3;reverse:5-GACTCTTGATAAACTTACCAGCC-3.C3封闭的非标记探针的序列为:5-ACAACTTCAGAGTCTATCATGGTGTGAAG-3。以组织基因组DNA为模板，反应总体积20μl，其中FermantasTaq(5U/μl)0.2μl，10×PCRBuffer(Mg2+Plus)2μl，dNTPMixture(10mM)0.4μl，前向引物（1∶20稀释）、反向引物各1μl，探针1μl，LC-Green荧光染料0.6μl。不对称PCR条件:预变性95℃10min，55个循环扩增（95℃10秒，56℃15秒，72℃25秒）。在不对称PCR体系中，由于添加了过量的反向引物，故PCR反应在耗尽前向引物扩增长度131bp的扩增子后，在仅存反向引物的情况下形成较多的正义链（单链）。　　2.3.2HRM分析　　分析条件为95℃2min，40℃2min，65℃～85℃梯度以0.02s/STEP升温观察熔解曲线变化。由于与rs8034191或rs401681野生型探针序列吻合，在不对称PCR反应中形成的正义链（单链）能与探针杂交形成探针结合链。因此，反应体系中存在两种不同的产物，即131bp的扩增子与25bp的探针结合链。在HRM分析中，分别形成两种熔解峰:主峰与探针峰。由于探针结合链在探针设计时即设定为Tm值小于扩增子Tm值，所以在升温熔解过程中探针结合链首先解链，形成探针峰。如果标本为野生型，则与探针完全匹配，形成的探针单峰具有较高的Tm;如果标本为纯合突变型，则与探针不匹配，其Tm值小于野生型Tm值，形成的探针单峰具有较低的Tm，位于野生型探针峰的左侧;如果标本为杂合突变，则在野生型与突变型位置都存在探针峰，为双峰，且峰型据标本所含突变比例的变化而变化。因此通过分析标本熔解曲线的变化，可以检测标本是否存在突变。　　2.4PCR产物测序　　使用上述正向及反向引物对30例肺癌及正常人基因组DNA进行PCR扩增，并将扩增产物直接送检测序（上海生物工程公司）　　2.5组织总RNA提取及实时定量PCR检测　　使用总RNA提取试剂盒在石蜡样本中提取肺癌组织总RNA，经逆转录后，使用实时定量PCR法分别检测CLPTM1L和AGPHD1基因的表达水平，观察rs401681和rs8034191不同基因型对其所在基因表达的影响。　　2.6数据分析和统计学处理　　采用SPSS16.0软件对数据进行分析。所有肺癌与正常样本符合Hardy-Weinberg平衡，SNP位点次要等位基因频率（minorallelefrequency，MIF）在患者于对照之间的比较使用卡方检验或Fisher检验。相关性的强弱使用优势比(oddsratio)OR和95％可信区间表示。不同基因型组之间基因表达的比较使用Graphpad软件分析，使用的统计学方法是非参数T检验法。P＜0.05表示差异有显著性意义。　　3.结果　　共对492例肺癌组织标本和486例健康配对标本的基因组DNA中染色体5p15.33区域的SNP位点rs401681和15q25.1区域SNP位点rs8034191的多态性进行了检测和分析。肺癌患者和健康人群相比，rs401681位点等位基因频率有显著性差异(p＜0.05)，而rs8034191SNP位点基因型以及等位基因型分布频率无显著性差异。在病理分型分组比较中，处于TERT-CLPTM1L基因的rs401681位点等位基因C/T的频率与非小细胞肺癌密切相关(p=0.012，OR=1.29，95％可信区间=1.09-1.50)，但与小细胞肺癌没有明显的相关性(p=0.571，OR=1.15，95％可信区间=0.82-1.47)。在小细胞肺癌患者中rs8034191SNP位点基因型频率及等位基因型频率与非小细胞肺癌患者人群和正常对照人群均有显著性差异(p=0.024)。此外，在rs8034191等位基因含突变型C（CC或CT型）的患者组织中AGPHD1基因的表达较TT型的患者低。而在不同rs401681基因型的患者组织中CLPTM1L的表达没有明显差异。　　4.结论　　在中国人群中，CLPTM1L基因上的SNP位点rs401681的遗传变异与肺癌——特别是非小细胞肺癌——的发病有密切的相关性。此外，AGPHD1基因区域SNP位点rs8034191的多态性与肺癌的易感性无关，但是亚组分析发现与小细胞肺癌的易感性相关。rs8034191等位基因含C(CT或CC)的肺癌患者癌组织内的AGPHD1基因的表达水平较纯合野生型(TT)患者低。