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犬细小病毒(Canine parvovirus)属于自主复制性细小病毒科,细小病毒属,猫细小病毒亚群(parvovirinae)。犬细小病毒(CPV)对于犬及犬科动物来说都是一个重要的病原,它能引起急性肠炎,白细胞减少,呕吐,以及幼犬的心肌炎等病症。早在1967年,Binn等从犬分离到第一种犬细小病毒一犬微小病毒(minute virus of canine. MVC),后命名为CPV-1。而后美国学者Eugster和Nairn从患出血性肠炎的病犬粪便中首先观察到CPV,并于1978年由澳大利亚的Kelly和加拿大的Thomson等首次从患肠炎的病犬中分离到,为了与CPV-1区别,这次分离到的CPV被命名CPV-2,随后在全世界十多个国家被证实。CPV-2在致病性和抗原性上与CPV-1显著不同。该病毒自1978年首先发现后,十分迅速的在世界范围内传播(1978-1981),随后CPV-2型犬细小病毒被新的抗原变异株取代,即:犬细小病毒2a亚型(CPV-2a),犬细小病毒2b亚型(CPV-2b),犬细小病毒2c亚型(CPV-2c)。本研究旨在探究犬细小病毒的流行和变异情况,通过对南京某宠物医院疑似犬细小病毒病例进行病毒分离,分离出一株犬细小病毒,经形态学、理化学、生物学和分子病毒学等鉴定:病毒能在CRFK细胞上生长,并产生细胞肿胀、变圆、破碎、脱落等细胞病变;病毒粒子呈立体对称,直径为20-24nm,无囊膜,抗氯仿,耐酸,耐热;能凝集猪红细胞,不能凝集人、鸡、豚鼠、兔的红细胞,并能被已知的犬细小病毒阳性血清所抑制。用犬细小病毒(CPV)特异性引物对病毒进行PCR扩增,能够扩增出CPV特异性片段。动物实验表明,试验组犬均出现细小病毒症状。对所分离的犬细小病毒核苷酸进行核苷酸序列分析,根据GenBank公布的CPV基因序列,设计两对引物对CPV/nj01/06的5’端和3’端进行扩增,经测序拼接后,得到长约4600bp并涵盖所有阅读框架的基因组。对由核苷酸序列推导的非结构蛋白NS1分析发现:NS1蛋白显示出略带酸性的特征,整段蛋白以α螺旋为主,且无规律性的出现折叠和转角。蛋白N端与C端显示出较强的亲水性特性。同样对结构蛋白VP2分析发现,VP2蛋白主要存在2段明显的强亲水性区域,一个位于内部(340-420位氨基酸),分析是潜在跨膜区;另一个位于N端(5-30位氨基酸),为潜在信号肽序列。通过参考其他CPV VP2基因序列构建CPV VP2序列核苷酸系统发生树,通过该发生树发现,CPV/nj01/06株与其他细小病毒序列同源,并与中国、越南、中国台湾、日本的犬细小病毒分离株VP2基因序列距离较近,而与美国,新西兰分离株的距离较远。此外,通过对犬细小病毒CPV/nj01/06株VP2蛋白关键氨基酸位点对比分析发现:CPV/nj01/06株属于犬细小病毒2a亚型(CPV-2a)。设计合成特异性引物,以CPV/nj01/06株为模板经PCR扩增VP2基因片断,将其克隆到pGEX-6p-1载体中,并转入表达宿主菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后表达得到目的蛋白,分子量大小与期望值相同,通过对诱导时间、温度的条件的摸索,确定融合蛋白在37℃、IPTG浓度为1.0mmol/L,诱导6h蛋白表达量为最优。细菌破碎后,目的融合蛋白主要存在于沉淀内,说明该表达蛋白为包涵体形式存在。通过Western blot证明该重组蛋白构建成功,体外表达存在低蛋白分子量表达,但它们同时具有细小病毒反应原性。