论文部分内容阅读
目的:糖尿病心肌病（Diabetic Cardiomyopathy,DCM）,是由糖尿病所导致的整个机体血糖水平异常,由高糖环境引起的累积心血管系统的严重并发症。DCM主要的病理变化为心肌细胞肥大,严重时可出现心肌纤维灶性坏死,继而出现心肌纤维化。到目前为止,DCM中的潜在机制尚不清楚。环状RNA（circ RNA）是一类新型的调节性RNA,参与多种心脏病理进程。但是,由MAP3K5基因转录而来的环状RNA（circ MAP3K5）在DCM中的调节作用仍不清楚。在此,我们旨在探讨circ MAP3K5在DCM中诱导的心肌细胞凋亡的机制研究。方法:1.选取H9c2细胞系（大鼠胚胎心肌细胞）作为实验对象,使用高糖培养基（25 m M）暴露48小时建立糖尿病心肌病细胞模型;同时使用低糖培养基（5.5 m M）设立对照组[1,2],并使用RT-q PCR检测糖尿病心肌病细胞模型中的circ MAP3K5是否有差异。2.使用si-circ MAP3K5与si-circ MAP3K5 vector分别转染H9c2细胞,转染成功后置于高糖环境暴露48小时,并通过Western Blotting（Cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2）与流式细胞术检测上述四组样品中的凋亡水平（Annexin V/PI）。3.使用生物信息学工具（Miranda软件,参数默认）预测circ MAP3K5下游结合分子,使用双荧光素酶报告基因进行验证,并通过RT-q PCR检测DCM组中其下游分子的表达量较对照组相比是否存在差异。4.将si-circ MAP3K5与p Lc-circ MAP3K5转染到H9c2细胞中,使用RT-q PCR检测mi R-22-3p的表达量是否受到上游circ RNA表达量的变化而变化,随后使用Western Blotting检测凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比例的相对表达量的变化。5.使用生物信息学工具（Miranda软件,参数默认）预测mi R-22-3p下游结合分子,使用双荧光素酶报告基因进行验证,并通过RT-q PCR检测DCM组中其下游结合分子的表达量较对照组是否存在差异。6.将mi R-22-3p mimic以及mi R-22-3p inhibitor分别转染到H9c2细胞中,使用RT-q PCR检测其下游m RNA DAPK2的相对表达量是否受到上游mi RNA表达量的变化而变化,随后使用Western Blotting检测凋亡相关蛋白Cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比例的相对表达量的变化。7.将si-circ MAP3K5与p Lc-circ MAP3K5分别转染到H9c2细胞中,并置于高糖环境中暴露48小时制备DCM模型,并观察与对照组以及未进行转染的单纯DCM组进行对比,在蛋白水平检测m RNA DAPK2的相对表达量是否受到Circ MAP3K5的调控。8.将mi R-22-3p inhibitor与pc DNA-DAPK2分别si-Circ MAP3K5共转染到H9c2细胞中,然后将其暴露于高糖环境48小时制备DCM模型,观察mi R-22-3p inhibitor与pc DNA-DAPK2是否可以逆转si-circ MAP3K5对于DCM所导致的心肌细胞凋亡的保护作用。结果:1.对照组与DCM组中circ MAP3K5的检测通过RT-q PCR检测,circ MAP3K5在DCM组中的表达量较对照组显著上升。2.凋亡水平检测分别使用Western Blotting（Cleaved caspase-3和Bax/Bcl-2比值）和流式细胞术（Annexin V/PI）检测各组之间的凋亡水平。结果显示:2.1 DCM组的凋亡水平显著高于对照组。2.2 DCM+si-circ MAP3K5组的凋亡水平显著低于DCM组。2.3 DCM+si-NC组的凋亡水平并未显著低于DCM组。说明在DCM中,circ MAP3K5的敲除或敲低可以有效改善高糖环境对心肌细胞所带来的凋亡损伤。3.生物信息学工具以及双荧光素酶实验验证其结合位点并验证使用生物信息学工具Miranda软件（参数默认）对其结合位点进行预测,确定备选下游基因mi R-22-3p,并使用双荧光素酶报告基因对具体结合位点进行验证,结果显示:circ MAP3K5野生型组与circ MAP3K5突变组相比,荧光强度明显下降,说明circ MAP3K5与mi R-22-3p二者之间实际存在直接结合关系,使用RT-q PCR检测DCM组中mi R-22-3p的相对表达量较对照组呈明显下降趋势,显示circ MAP3K5与mi R-22-3p二者的表达量在DCM的条件下呈现反向趋势。4.Circ MAP3K5与mi R-22-3p的调控关系以及凋亡水平检测使用RT-q PCR检测调控circ MAP3K5之后mi R-22-3p的表达量,证实二者之间存在负调控关系,表明circ MAP3K5可能发挥竞争性内源RNA机制（ce RNA）,发挥像海绵一样的吸附作用将mi R-22-3p结合并抑制其表达。此外Western Blotting凋亡验证显示,敲除circ MAP3K5之后,凋亡水平呈现下调趋势;同时,过表达circ MAP3K5后,凋亡水平呈现上升趋势。5.生物信息学工具以及双荧光素酶实验验证其结合位点并验证使用生物信息学工具Miranda软件（参数默认）对其结合位点进行预测,确定备选下游m RNA DAPK2,并使用双荧光素酶报告基因对具体结合位点进行验证,结果显示:DAPK2野生型组与DAPK2突变组相比,荧光强度明显下降,说明mi R-22-3p与DAPK2二者之间实际存在直接结合关系,使用RT-q PCR检测DCM组DAPK2的表达量较对照组呈明显上升趋势,显示mi R-22-3p与DAPK2二者的表达量在DCM的条件下呈现反向趋势。6.Mi R-22-3p与DAPK2的调控关系以及凋亡水平检测使用RT-q PCR检测调控mi R-22-3p之后DAPK2的表达量,证实二者之间存在负调控关系。此外Western Blotting凋亡验证显示,抑制mi R-22-3p的表达量之后,凋亡水平呈现上升趋势;同时转染mi R-22-3p mimic后,凋亡水平呈现下降趋势。7.Circ MAP3K5与DAPK2的相关性分析通过Western Blotting分析证实,DCM组DAPK2的表达量较对照组显著上升,而在敲除circ MAP3K5之后的DCM组中,DAPK2的表达量明显下降;与此同时,在DCM组与对照组中,过表达circ MAP3K5均可引起DAPK2较前显著上调,说明二者之间可能存在正向调控关系。8.Circ MAP3K5通过调节mi R-22-3p/DAPK2轴促进DCM中心肌细胞凋亡根据Western Blotting结果显示,DCM中凋亡水平呈上升趋势,但circ MAP3K5的敲除可以挽救这种损伤,与此同时mi R-22-3p inhibitor和pc DNA-DAPK2的介入可以逆转circ MAP3K5的敲除对于DCM心肌细胞凋亡中的这种保护作用。结论:因此,我们认为circ MAP3K5可以通过调控mi R-22-3p/DAPK2轴促进高糖诱导的心肌细胞凋亡。我们的发现为circ MAP3K5调节糖尿病心肌病相关心功能损害的机制提供了新的见解。这也表明,circ MAP3K5、mi R-22-3p和DAPK2可能是糖尿病所致心脏损伤的潜在治疗靶点。