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胚胎停育(embryo demise)是一种严重影响妇女身心健康的疾病,有统计认为其占早期妊娠的10%-18%,且随着二胎政策的放开及高龄产妇的增加,发病率有逐年上升的趋势。胚胎停育病因复杂[1],包括遗传因素、免疫因素、解剖异常、内分泌异常、感染等,在各种致病因素中,胎儿遗传因素、免疫因素、内分泌异常是导致胚胎停育最主要的三大原因。脆性X智力低下基因5′端非翻译区的(CGG)n串联重复序列异常扩增,可导致卵巢功能不全和胎儿隐性或显性的发育障碍,甚至是胎儿畸形,是除唐氏综合征外的第二大胎儿染色体致智力低下因素。此外,携带有脆性X智力低下基因妇女可能造成潜在风险的卵巢功能障碍,对于女性的生殖功能造成影响,而且非整倍体妊娠流产的发生率高[2]。据此推测,胚胎停育可能与脆性X智力低下基因5′端非翻译区的(CGG)n串联重复序列异常扩增相关。另据报道,母胎界面绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10四种因子对于滋养细胞的最佳增殖和建立足够的母婴循环、子宫内膜血管化、胚胎植入和发育、胎儿血管生成发育[3],母胎免疫耐受的建立[4]、胎盘及胎儿的发育至关重要[5]。我们通过试验检测了绒毛组织中上述四因子的表达情况,试图解释其与FMR1(CGG)n串联重复序列异常扩增及其与胚胎停育的相关性,为进一步研究胚胎停育的病因提供新的思路。
本研究通过AmplideX FMRl PCR 方法检测胚胎停育患者及正常对照组的FMR1基因(CGG)n重复数目,应用组织芯片-免疫组化技术检测其绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10四种因子的表达及分布,同时收集相关的临床资料、性激素水平进行分析,探讨胚胎停育患者FMR1基因(CGG)n重复数目,绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10的差异性表达和性激素水平与胚胎停育的关系,并分析FMR1基因(CGG)n重复数目、上述四因子、性激素水平之间的联系性。
选取2017.06-2018.11之间在空军特色医学中心妇产科就诊的98例胚胎停育患者做为病例组,选取与之孕周匹配的108例正常产检的健康孕妇做为对照组。应用AmplideX FMRl PCR方法对两组孕妇的X染色体进行扩增,检测其(CGG)n重复数目。应用组织芯片-免疫组化技术检测绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10表达情况,并收集相关的临床资料及绒毛膜促性腺激素(HCG)、雌二醇(E2)、孕酮(P)水平进行分析。
经AmplideX FMRl PCR方法检测得出:病例组及对照组FMR1 (CGG)n重复数目频率最高分别为30和29,两组FMR1(CGG)n重复数目最高值及均数均无统计学差异(P值分别为0.642、0.450),还对于FMR1(CGG)n数目高于34进行了单因素分析,病例组与对照组之间亦无统计学差异。病例组有2例中间基因型(49/36、45/30)、1例全突变(200/97/30),对照组有2例中间基因型(45/30、46/20)、1例前突变( 67/29 ) ,且全部是两组中等位基因2发生了突变。经Pearson correlation分析,等位基因2(CGG)n重复数目与胚胎停育的性激素(HCG、E2、P)水平差异无显著性(P值分别为0.694、0.517、0.620)。
经组织芯片-免疫组化技术检测,VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在两组绒毛组织中均有不同程度上的表达,且在病例组绒毛组织中表达水平明显低于对照组。VEGF在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为40%、90%;PD-1在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为12.5%、90%;PD-L1在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为12.5%、97.5%;PEG10在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为25%、85%.VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10四组因子的阳性率应用统计学分析显示卡方值分别为32.618、53.308、71.158、42.856,P值均小于0.01,有统计学意义;经Pearson correlation分析,等位基因2(CGG)n重复数目与两组绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10的表达水平无相关性(P值分别为0.326、0.351、0.463、0.620)。
综上所述,本研究通过应用AmplideX FMRl PCR方法检测胚胎停育患者FMR1等位基因(CGG)n重复数目,及应用组织芯片-免疫组化方法检测VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在胚胎停育患者绒毛组织中的表达,得出的结论为:1、胚胎停育患者与正常对照组均检测到两例等位基因2的突变,但两组FMR1(CGG)n数目无显著性差异。胚胎停育与FMR1(CGG)n数目无直接相关性。2、发生胚胎停育时HCG、P水平明显低于正常对照组,但与FMR1(CGG)n数目无相关性。胚胎停育时发生HCG、P水平下降可能与FMR1(CGG)n数目并无直接关系。3、VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在胚胎停育时均处于低表达。VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在两组绒毛组织中的表达水平与FMR1(CGG) n数目无相关性。VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10各因子之间在绒毛组织中的表达存在相关性,PD-L1与其他三因子还显示存在依存关系。
胚胎停育原因是复杂性和多因素的,FMR1的突变常发生于等位基因2,单独检测FMR1(CGG)n数目并不反映胚胎停育时的激素水平,不能做为预测胚胎停育发生的指标。VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在绒毛组织中的差异性表达,与胚胎停育的发生具有相关性,其中, PD-L1与其因子的协同作用还有待于进一步的研究。
本研究通过AmplideX FMRl PCR 方法检测胚胎停育患者及正常对照组的FMR1基因(CGG)n重复数目,应用组织芯片-免疫组化技术检测其绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10四种因子的表达及分布,同时收集相关的临床资料、性激素水平进行分析,探讨胚胎停育患者FMR1基因(CGG)n重复数目,绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10的差异性表达和性激素水平与胚胎停育的关系,并分析FMR1基因(CGG)n重复数目、上述四因子、性激素水平之间的联系性。
选取2017.06-2018.11之间在空军特色医学中心妇产科就诊的98例胚胎停育患者做为病例组,选取与之孕周匹配的108例正常产检的健康孕妇做为对照组。应用AmplideX FMRl PCR方法对两组孕妇的X染色体进行扩增,检测其(CGG)n重复数目。应用组织芯片-免疫组化技术检测绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10表达情况,并收集相关的临床资料及绒毛膜促性腺激素(HCG)、雌二醇(E2)、孕酮(P)水平进行分析。
经AmplideX FMRl PCR方法检测得出:病例组及对照组FMR1 (CGG)n重复数目频率最高分别为30和29,两组FMR1(CGG)n重复数目最高值及均数均无统计学差异(P值分别为0.642、0.450),还对于FMR1(CGG)n数目高于34进行了单因素分析,病例组与对照组之间亦无统计学差异。病例组有2例中间基因型(49/36、45/30)、1例全突变(200/97/30),对照组有2例中间基因型(45/30、46/20)、1例前突变( 67/29 ) ,且全部是两组中等位基因2发生了突变。经Pearson correlation分析,等位基因2(CGG)n重复数目与胚胎停育的性激素(HCG、E2、P)水平差异无显著性(P值分别为0.694、0.517、0.620)。
经组织芯片-免疫组化技术检测,VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在两组绒毛组织中均有不同程度上的表达,且在病例组绒毛组织中表达水平明显低于对照组。VEGF在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为40%、90%;PD-1在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为12.5%、90%;PD-L1在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为12.5%、97.5%;PEG10在病例组及对照组绒毛组织中的阳性率分别为25%、85%.VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10四组因子的阳性率应用统计学分析显示卡方值分别为32.618、53.308、71.158、42.856,P值均小于0.01,有统计学意义;经Pearson correlation分析,等位基因2(CGG)n重复数目与两组绒毛组织中VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10的表达水平无相关性(P值分别为0.326、0.351、0.463、0.620)。
综上所述,本研究通过应用AmplideX FMRl PCR方法检测胚胎停育患者FMR1等位基因(CGG)n重复数目,及应用组织芯片-免疫组化方法检测VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在胚胎停育患者绒毛组织中的表达,得出的结论为:1、胚胎停育患者与正常对照组均检测到两例等位基因2的突变,但两组FMR1(CGG)n数目无显著性差异。胚胎停育与FMR1(CGG)n数目无直接相关性。2、发生胚胎停育时HCG、P水平明显低于正常对照组,但与FMR1(CGG)n数目无相关性。胚胎停育时发生HCG、P水平下降可能与FMR1(CGG)n数目并无直接关系。3、VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在胚胎停育时均处于低表达。VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在两组绒毛组织中的表达水平与FMR1(CGG) n数目无相关性。VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10各因子之间在绒毛组织中的表达存在相关性,PD-L1与其他三因子还显示存在依存关系。
胚胎停育原因是复杂性和多因素的,FMR1的突变常发生于等位基因2,单独检测FMR1(CGG)n数目并不反映胚胎停育时的激素水平,不能做为预测胚胎停育发生的指标。VEGF、PD-1、PD-L1、PEG10在绒毛组织中的差异性表达,与胚胎停育的发生具有相关性,其中, PD-L1与其因子的协同作用还有待于进一步的研究。