美国癌症协会预计2008年美国女性乳腺癌有182460新发病例,40480死亡病例,发病率26%居肿瘤的第一位[1]。尽管亚洲是乳腺癌低发区,但在我国经济发达地区,乳腺癌呈明显的上升趋势,每年新增病例达3-4%,成为发病率上升最快的恶性肿瘤之一,而且有年轻化趋势[2]。人们面临如此庞大的乳腺癌患者,寻找肿瘤相关基因、合理治疗以提高生存率显然是目前亟待解决的问题。乳腺癌患者术前新辅助化疗是临床治疗的一大进展,不但使更多患者获得了手术根治的机会,而且还使不少化疗后病理完全缓解的患者延长了生存。另外,由于分子生物学已深入应用到肿瘤领域的各个方面,乳腺癌也从临床试验为依据的循证医学治疗模式逐渐向更完美的个体化治疗转化。但是目前的个体化治疗仍多基于简单的临床病理特征而制定治疗方案,所达到的效果并不理想,这也是肿瘤内科所面临的重要问题。因此只有真正认识每个个体的肿瘤基因表达情况,才有可能达到有的放矢的治疗,为患者选择合理、有效的方案,避免治疗不足或治疗过度带来的毒副反应和经济负担。本研究课题即围绕上述问题进行了初步探讨。第一部分对乳腺癌的新辅助治疗中临床存在的一些问题进行了初步探讨。乳腺癌新辅助化疗(NAC)目前已成为乳腺癌的标准治疗,治疗后获得病理学完全缓解(pCR)的患者预后最好,因此在我国也普遍开展。但国外关于NAC疗效评价手段的研究不够详细,国内更是鲜有报道,因此我们主要比较了查体、B超和钼靶在乳腺癌NAC疗效评价中的差异,并分析治疗前后肿瘤特征的变化。方法是对我院141例新辅助化疗患者,通过查体、B超和钼靶分别测量记录肿瘤状况,分析治疗前后原发灶、淋巴结、受体状态的变化。结论是化疗前腋窝淋巴结的病理判断,不论是穿刺或前哨活检都非常重要;查体、B超及钼靶对肿瘤的判断都有相当的误差;化疗中可采用病灶穿刺评价NAC疗效,但对结果的判断还需综合分析;需检测治疗前后的受体状态,根据总体分析选择术后靶向ER或HER-2的治疗,争取使患者更多获益。根据此研究结果,我们设计了新辅助的前瞻性临床试验,为下一步基因表达研究提供基础。第二部分分别研究了冰冻和石蜡包埋(FFPE)的两种乳腺癌组织的RNA提取及基因表达情况。医院病理科有大量的档案FFPE样本,由于乳腺癌患者的生存期较长,可收集保存数年的FFPE样本进行回顾性研究而获得大量的基因信息,用于研究肿瘤的分子分类、分型及对治疗的反应、肿瘤复发转移和预后的潜在生物学标记等方面,具有重要的应用前景。但FFPE样本RNA的提取存在一定困难, RNA降解较为严重。因此我们分别探索从冰冻和石蜡包埋的两种乳腺癌样本中提取总RNA的质量和产量,并检测其基因的表达情况。方法是收集保存时间1~17年不等的人乳腺癌石蜡组织样本153例,收集冰冻及其石蜡包埋的人乳腺癌组织共5对,取5μm厚切片1～15张,试剂盒提取总RNA。随机引物法将mRNA反转录为cDNA,SYBR Green ?染料法实时荧光定量PCR分析两种样本的mRNA表达情况,并对不同保存时间的石蜡样本,比较扩增管家基因不同产物长度的Ct值差异,以了解RNA降解程度。结果,153例石蜡标本总RNA浓度在3～375ng/μl范围,总产量0.18～18.5μg,A260/280值在1.32～2.07范围,RNA片段弥散在100~1000bp之间,峰值在200bp左右,冰冻样本RNA可见清晰的28S、18S条带。石蜡样本扩增90bp长度ACTB基因的有效RNA模板量仅占相应冰冻样本的0.46倍(p<0.05),两种样本的RNA完整性有显著差别。冰冻样本扩增90bp产物的Ct值显著低于203bp的Ct值(p=0.02),提示冰冻样本RNA也有一定降解。石蜡样本mRNA表达与相应的冰冻样本无显著差异(p>0.05),相关性分析显示二者有显著相关性。81例样本的4个管家基因的平均Ct值在24～30范围,随着样本保存时间的延长,Ct值也逐渐增加。扩增不同保存时间石蜡样本的三个长度片段的Ct值均有显著差异,随着扩增片段的增大,Ct值也逐渐增加。结论是冰冻样本的RNA相对较完整,质量较好;石蜡样本的RNA有明显降解,但尚能够准确反应组织mRNA水平上的表达情况;FFPE样本的RNA量可满足实验的要求,可以进行mRNA的检测,保存10年以上的样本也能够进行基因表达研究;石蜡样本的Ct值随扩增片段的增大而逐渐增加,能顺利扩增150bp左右长度的产物,为石蜡样本的进一步广泛研究提供实验基础。第三部分探讨了乳腺癌患者的21基因表达研究及预后分析。目前关于乳腺癌的预后判断仍停留在传统的基于临床特征的基础上,任何一种方法都不能准确无误地判断患者的预后,因此治疗也就会变得盲目、不足或过度。近年来国外学者进行了一些大样本、高通量的基因表达研究,21基因即是其中最好的研究之一。由21个基因表达水平计算出的复发分数(RS)来判断危险性,对预后有显著预测意义。但RS检测花费昂贵,尚不能在中国进行,且RS没有在中国患者中的数据结果,因此我们试图采用我们的实验方法研究RS在中国乳腺癌患者中的预后价值及应用前景。方法是根据我们制定的患者筛选条件,收集我院病理科的乳腺癌FFPE样本及部分外院样本。试剂盒提取总RNA,采用随机引物将mRNA反转录为cDNA,SYBR Green ?染料法实时荧光定量PCR检测表达情况,据文献报道方法计算RS。结果,共收集石蜡样本109例,有16例样本的RT-PCR扩增结果较差,共有93例有完整的结果。全组为激素受体(HR)阳性、淋巴结(LN)阳性或阴性的早期乳腺癌患者,中位随访时间65.9个月。主要研究终点是无远处复发生存(DRFS),约半数患者(45/93)发生了远处复发。采用文献报道的QRT-PCR判断ER、PR和HER-2状态的界值,将mRNA水平分别与IHC/FISH检测的相应蛋白水平进行比较。这两种方法检测ER、PR和HER-2的Kappa系数分别是0.59、0.44和0.63。RS评估危险度后,低危、中危、高危三组的远处复发率有显著差异(p<0.001),高危组的DRFS显著低于低危和中危组,RS对预后有预测意义。亚组分析中,RS在LN阴性(p=0.009)和阳性者(p=0.038)中均有预后意义。单因素及多因素分析显示LN状态、辅助内分泌治疗和RS均是显著的预后因素。与其他危险评估方法相比,在预后差患者中,RS判断需要给予辅助化疗的比例较St. Gallen共识判断的结果小(81.6% vs 94.7%),但无统计学差异(p>0.05);而在预后较好者中,RS分组认为需给予化疗以降低复发风险的患者显著减低(50.9% vs 90.9%,P<0.001)。结论,我们建立了简便、经济的QRT-PCR方法,其判断ER和HER-2状态与IHC的结果一致性较好,判断PR的结果一般,与原21基因的Taqman探针法结果相似、具有可比性。RS与LN阴性或阳性、HR阳性乳腺癌患者的远处转移有显著的相关性。RS较传统的危险评估方法能更准确地判断预后,并降低辅助化疗的比例,初步探讨了RS在中国乳腺癌患者中的预后价值及临床应用前景。第四部分研究了乳腺癌患者的microRNA表达情况及临床分析。microRNA(miRNA)在转录后对各种基因进行调控,在细胞增殖、生长、分化、以及肿瘤的发生发展中发挥重要的调节作用。由于miRNA作用机制及调控的复杂多样性,真正确认功能的miRNA较少。目前已有一些实验证实了与乳腺癌侵袭、转移相关的miRNA,并初步在临床样本中得到了数据支持体外实验的结果。我们参考文献报道,选取了几个与乳腺癌转移、临床特征相关的miRNA,初步探讨其在乳腺癌样本中的表达情况以及与临床特征和转归的关系。方法为试剂盒提取包含miRNA的总RNA,采用特异性含茎环结构的反转录引物分别反转录,用Taqman探针法检测miRNA的表达。结果,共有57例样本,其中miR-373的Ct值多>35.0。本组样本的miRNA表达情况服从正态分布,根据ΔCt值的均数分为高表达和低表达两组。主要研究终点是无病生存期(DFS)。仅有miR-21高表达与肿瘤较小有显著关系(p=0.046),miR-206与ER蛋白的表达无显著相关性(p=0.449)。miR-10b对全组患者的预后有预测意义,miR-335、-10b和-21对HR阴性的患者有预后意义,均为高表达者预后较好,而与HR阳性者预后无显著关系。其中,miR-335和-10b与骨转移显著相关(p=0.015)。结论,miR-373在乳腺癌组织中表达很低,结果不一定可靠,难以分析;miR-21高表达与肿瘤较小显著相关;miR-206与ER蛋白的表达无显著相关性;miR-10b高表达者预后较好,HR阴性者中,miR-335、-10b和-21高表达的预后较好;miR-335和-10b高表达发生骨转移显著减少。总之,本研究从FFPE样本中研究mRNA及miRNA的表达情况,为从乳腺癌样本中开展大量的回顾性或前瞻性研究提供了实验基础。在此基础上,采用简便经济的方法研究了21基因在中国乳腺癌患者的表达情况,验证了RS对预后的预测能力及临床应用前景。从miRNA角度研究了与临床转归相关的重要miRNA,为进一步地研究miRNA功能及其靶基因提供了临床数据资料。对乳腺癌新辅助化疗中不同疗效评价手段及受体变化进行了初步探讨,为今后开展正规、标准的新辅助化疗提供了方向,并设计了新辅助前瞻性临床试验,为进一步基因表达研究提供基础。