【摘 要】
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石斑鱼已成为中国南方沿海和东南亚地区的重要经济海水鱼类。新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海水鱼高致病的病原,可引起石斑鱼大量死亡。本文以石斑鱼为研究对象,分析石斑鱼MKK4/6基因和miR-122在SGIV/V.alginolyticus刺激后表达特征,对AP-1/NF-κB激活情况,
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石斑鱼已成为中国南方沿海和东南亚地区的重要经济海水鱼类。新加坡石斑鱼虹彩病毒（Singapore grouper iridovirus,SGIV）和溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是海水鱼高致病的病原,可引起石斑鱼大量死亡。本文以石斑鱼为研究对象,分析石斑鱼MKK4/6基因和miR-122在SGIV/V.alginolyticus刺激后表达特征,对AP-1/NF-κB激活情况,探讨其对病毒诱导的细胞凋亡的影响,结果如下:1.从斜带石斑鱼（Epinephelus coioides）中克隆Ec MKK4基因和Ec MKK6基因,即Ec MKK4-1、Ec MKK4-2、Ec MKK4-3和Ec MKK6。保守结构域预测,发现Ec MKK4均含S＿TKc结构域和两个ATP结合基序;Ec MKK6含有S＿TKc结构域、酪氨酸激酶结构域和DVD结构域。同源性比较和进化树分析表明,Ec MKK4均与大黄鱼（Larimichthys crocea）相似度高,分别达到97.15%、98.12%和97.53%;Ec MKK6与尖吻鲈（Laters calcarifer）的相似性最高,达到98%。2.Ec MKK4/6在石斑鱼的11个组织中均有分布,Ec MKK4在肠道组织中的表达水平较高,Ec MKK6在头肾的表达水平较高。SGIV和溶藻弧菌感染石斑鱼后,Ec MKK4和Ec MKK6呈现差异表达。通过双荧光素酶报告基因结果显示,Ec MKK4/6显著抑制AP-1活性。最后通过流式细胞仪检测到Ec MKK4/6抑制SGIV感染诱导的细胞凋亡,以上结果表明,Ec MKK4/6参与了石斑鱼抗病毒/细菌刺激反应。3.石斑鱼miR-122与哺乳动物和其他鱼类的miR-122相似度极高。SGIV感染可诱导石斑鱼细胞miR-122持续表达。miR-122通过抑制AP-1和NF-κB转录因子的活性和促凋亡因子的表达,进一步抑制caspase-3活性和SGIV诱导的细胞凋亡;此外miR-122促进病毒在细胞中的复制与增殖,表现为miR-122增强了SGIV诱导的CPE进程,增加病毒基因的转录表达水平,上调MCP蛋白表达水平和增强子代病毒产生。综上所述:本文克隆得到石斑鱼Ec MKK4和Ec MKK6,且在物种间的进化是高度保守的;SGIV和溶藻弧菌刺激后,Ec MKK4/6呈现差异表达;并抑制SGIV诱导的细胞凋亡,推测Ec MKK4/6参与石斑鱼的先天免疫应答。SGIV感染过程中miR-122通过下调免疫信号和炎症因子表达,调节诱导的细胞凋亡,从而促进病毒复制。
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