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研究背景结直肠癌(colorectal cancer, CRC)在肿瘤相关性死亡病例中排在第四位，据统计每年约有608,700人因结直肠癌而死亡。近些年流行病学、临床和实验研究发现雌激素与结直肠癌发病有明显的关系，在过去的几十年里，美国结直肠癌死亡率女性患者下降明显，有分析认为雌激素替代疗法的流行是女性患病率下降的可能原因。目前所使用的结直肠癌化疗药物的治疗效果在年轻女性患者要优于男性患者，这说明雌激素除对女性结直肠癌患病具有保护作用外，在结直肠癌治疗中也有积极的作用，但确切的机制不明。最近研究报道结直肠癌患者癌组织中会出现miRNAs(microRNAs)表达谱的改变，包括miR-135b, miR-96, miR-183, miR-133a, miR-133b, miR-21, miR-31, miR-145,miR-203, miR-223, miR-155等，在结直肠癌中表达明显增加，但是miRNAs改变的原因及表达改变后如何促进结直肠癌的发生、发展，目前仍不清楚。已有研究显示雌激素可通过激活雌激素受体下调乳腺癌MCF-7细胞内miR-21表达，并增加其靶基因的表达。雌激素同样能够影响子宫内膜间质细胞和子宫平滑肌细胞内一些miRNAs的表达。雌激素受体阳性肿瘤中雌激素的表达与miRNA表达有一定关系。因此雌激素对结直肠癌的保护作用可能与雌激素对某些miRNAs表达的调节有关。部分结直肠癌的发生与DNA错配修复功能缺陷有关，在保持遗传稳定方面DNA错配修复(mismatchrepair, MMR)系统发挥着很重要的作用。错配修复基因突变包括遗传和散发性的突变，主要发生在致癌形成作用的早期阶段。通常能够检测出微卫星不稳定(microsatelliteinstability, MSI)或涉及DNA错配修复缺陷的基因主要为MLHI, MSH2, MSH6和PMS2。有研究显示雌激素和微卫星不稳定存在一定的关系，可增强主要的错配修复基因(hMLH1)在结肠上皮细胞的表达。雌激素还可诱导结肠癌细胞凋亡。但雌激素诱导错配修复功能增强和结肠癌细胞凋亡的机制不清。为了研究雌激素对错配修复基因调节的可能机制，是否有miRNAs参与，可能参与雌激素诱导结肠癌细胞凋亡的靶基因。我们拟进行实验验证结肠癌细胞中雌激素和雌激素受体拮抗剂ICI182,780对细胞内一些miRNAs(miR-31, miR-155, miR-135b,miR-203和miR-223)表达的影响，同时在18例结直肠癌患者组织中评价血清雌激素水平与miRNA和MMR表达的相关性。通过荧光素酶活性实验确定可能参与雌激素诱导结肠癌细胞凋亡的基因。目的1.研究结肠癌细胞中miRNA表达与雌激素的关系。2.研究结肠癌细胞中MMR表达与雌激素的关系。3.人体组织标本验证雌激素、miRNA和MMR表达的相关性。4.明确可能参与雌激素诱导结肠癌细胞凋亡的miRNA和靶基因。研究方法1.选用三种细胞进行实验，COLO205(细胞内有较高水平的ER-β表达，无ER-α)细胞、SW480细胞(细胞内仅有很低水平的ER-β表达)和MCF-7细胞(细胞内ER-α表达水平较高，而几乎检测不到ER-β表达)。不同浓度雌激素处理细胞流式细胞仪测定凋亡。10nM雌激素处理COLO205细胞0h,6h,12h和24h，提取雌激素处理前后的细胞总RNA，实时定量PCR(RT-qPCR)测定细胞内miR-31, miR-155, miR-135b,miR-203和miR-223的表达水平。细胞预先加入100nM雌激素受体抑制剂6h后，再加入雌激素处理12h，提取雌激素处理前后的细胞总RNA，实时定量PCR(RT-qPCR)测定细胞内miR-31, miR-155和miR-135b的表达。将ER-β质粒转染到SW480细胞内，增加细胞内ER-β的表达。收集转染后24h和48h的细胞，提取蛋白，Western blotting检测转染效果。雌激素处理转染pRST7-ER-β的SW480细胞，检测细胞内miR-31,miR-155和miR-135b的表达。2. COLO205、SW480和MCF7细胞为研究对象，10nM雌激素处理COLO205细胞0h,6h,12h和24h，RT-qPCR和Western blotting检测细胞内ER-β和MMR表达。预先加入100nM雌激素受体抑制剂6h后，再加入雌激素处理12h，提取雌激素处理前后的细胞总RNA和蛋白，检测细胞内ER-β和MMR表达。雌激素处理MCF-7和SW480细胞12h后，RT-qPCR和Western blotting检测细胞内ER-β和MMR表达。将ER-β质粒转染到SW480细胞内，增加细胞内ER-β的表达后，RT-qPCR检测雌激素对转染pRST7-ER-β的SW480细胞内hMLH1mRNA表达的影响。Western blotting检测雌激素对转染pRST7-ER-β的SW480细胞内hMLH1蛋白表达的影响。3.共收集18例结直肠癌患者血清样本，结直肠癌和癌旁标本，对雌激素、miRNA和MMR表达的相关性进行分析。4.转染miR-135b抑制剂到COLO205细胞内，转染24h后收集3h,6h,12h和24h的细胞测定凋亡，提取总RNA测定miR-135b表达。根据在线数据库UCSC(www.geome.ucsc.edu)确定LATS23′UTR，PCR在人基因组扩增LATS23′UTR并克隆到pGL3荧光素报告载体得到pGL3-LATS23’UTR Wt。同时应用QuikChange IIXL Site-Directed Mutagenesis Kit将载体LATS23’UTR序列中的miR-135b结合位点的核心区突变后，克隆到pGL3荧光素报告载体的荧光素酶基因下游得到pGL3-LATS23’UTR Mut。分别将两个载体与miR-135b模拟物或miR-NC共转染HEK-293细胞，pGL3荧光素报告载体为对照，转染24h后，收集细胞裂解液，用双荧光素酶试剂盒(Promega)测定荧光素酶活性。结果1.雌激素可诱导COLO205细胞凋亡，并存在一定剂量效应关系。雌激素能够抑制COLO205细胞内miR-31, miR-155和miR-135b的表达，并有时间依赖效应。COLO205细胞预先加入100nM雌激素受体抑制剂6h后，能够拮抗雌激素对细胞内miR-31, miR-155和miR-135b表达的抑制作用。雌激素对SW480和MCF-7细胞内miR-31, miR-155和miR-135b表达无明显抑制作用。ER-β质粒转染到SW480细胞内，经Western blotting检测发现，转染空载组细胞内ER-β蛋白表达量无变化，而转染pRST7-ER-β的SW480细胞内ER-β蛋白表达量明显增加。RT-qPCR结果显示雌激素可抑制转染pRST7-ER-β的SW480细胞内miR-31, miR-155和miR-135b的表达，而对空载组无影响。结果说明雌激素对细胞内某些miRNAs表达的影响，可能是由雌激素受体ER-β介导的。2. RT-qPCR和Western blotting结果显示，随着雌激素处理时间的增加，细胞内ER-β和hMLH1表达增加，hMSH2表达变化不明显。雌激素受体抑制剂可以抑制雌激素对细胞内ER-β和hMLH1表达的调节。雌激素处理MCF-7和SW480细胞12h后，细胞内hMLH1, hMSH2和ER-β表达无明显变化。将ER-β质粒转染到SW480细胞内，增加细胞内ER-β的表达后，RT-qPCR结果显示雌激素可上调转染pRST7-ER-β的SW480细胞内hMLH1mRNA的表达，而对空载组无影响。Western blotting结果显示雌激素可上调转染pRST7-ER-β的SW480细胞内hMLH1蛋白的表达，而对空载组无影响。雌激素对细胞内hMLH1表达的影响，可能与雌激素受体ER-β有关。3.血清雌激素水平与miR-31和miR-135b表达有明显的负相关，而与miR-155表达无相关性。我们同样发现，在结肠癌组织中，hMLH1mRNA表达水平与miR-155和miR-135b表达有明显的负相关，而ER-β mRNA表达与血清雌激素水平有明显的正相关性。miR-135b与血清雌激素水平，ER-β和hMLH1表达有相关性。但hMLH1表达与血清雌激素水平无明显相关性。4. miR-135b抑制剂转染COLO205细胞，随着细胞内miR-135b表达降低，细胞凋亡率明显增加。通过Target Scan和miRanda软件分析预测，荧光素酶活性实验证实miR-135b可以和LATS23’UTR结合。结论1.雌激素能够抑制COLO205细胞内miRNAs(miR-31, miR-155和miR-135b)的表达，上调hMLH1的表达，雌激素受体抑制剂能拮抗这一作用。相比于癌旁组织，癌组织中miR-135b表达明显增加。结肠癌组织内miR-135b和ER-β mRNA的表达与患者血清雌激素水平有一定相关性。2.当多数病人的血清雌激素浓度低于45pg/ml时，结直肠癌组织中hMLH1mRNA的表达与患者血清雌激素水平没有明显相关性。因此雌激素通过雌激素受体对MMR和miRNA的调节作用可能发生在肿瘤形成的早期，在肿瘤形成过程中，随着雌激素水平和/或雌激素受体表达降低miR-31、miR-155和miR-135b表达会逐渐增加，引起错配修复功能不稳，促进结直肠癌发生。3．雌激素诱导结肠癌细胞凋亡与抑制细胞内miR-135b表达有关，miR-135b的靶基因LATS2可能参与了这一机制。