酿酒酵母是一种单细胞真核生物,但其具有与高等真核生物相同的许多基因、细胞器和功能。其分泌路径在结构和功能上与哺乳动物分泌系统的许多情况相似,包括蛋白折叠和降解的能力,糖基化和分泌蛋白的能力。酿酒酵母适合于表达科学和商业上有价值的异源蛋白。由于它不会产生出毒素成分,加之广泛应用于食品生产的丰富经验已经使得他成为生产药物蛋白最优的宿主菌。由酿酒酵母生产的一系列广泛应用于全世界的糖尿病治疗的胰岛素便是酵母在生物技术领域应用的重要例子之一。然而,目前国内生产人胰岛素的技术还相对落后,使得国产胰岛素的生产成本远高于国际品牌。为了进一步提高酿酒酵母的外源蛋白分泌效率,我们构建了人胰岛素及干扰素的酵母表达质粒,并将其转化入酿酒酵母BJ5457菌株中,对蛋白表达条件进行了探索性试验。　　首先,我们应用重叠PCR方法构建编码人胰岛素原类似分子的反转录DNA。通过表达编码胰岛素原类似分子的反转录DNA能够使得折叠的单链胰岛素原样分子有效地分泌到培养上清中,这种胰岛素原类似分子B链第30个氨基酸苏氨酸被去除,并与酿酒酵母a因子前导肽融合,后面接人胰岛素原C肽替代物短肽(AAK)。被分泌的单链胰岛素前体随后可被纯化和进行后续的加工转化成人胰岛素。DNA序列分析显示,编码外分泌型胰岛素的基因构建成功。然后我们将胰岛素原样分子和蛋白二硫键异构酶的基因分别定向插入酵母表达质粒YEp和pWX530中构建分泌型重组表达载体YEp-PDI-Ins和WX530-PDI-Ins。重组质粒转化酿酒酵母BJ5457感受态细胞,在亮氨酸营养缺陷型培养基上筛选含重组质粒的酵母转化子菌落。对转化子酵母进行发酵培养,通过SDS-PAGE分析酵母培养液上清中的蛋白成分。含有重组表达质粒的酵母转化子可以在非诱导条件下表达外分泌型可溶性的胰岛素蛋白,其分子量大小与预期大小相近。我们的实验也表明过表达PDI,酿酒酵母的胰岛素原样分子的分泌效率有所提高。　　采用分光光度计比浊法测定酿酒酵母BJ5457在选择培养基YNB/Leu-中的生长曲线,确定菌体生长规律。结果表明,在酵母菌对数生长中期(OD为10.0)时以2％的接种量将酵母转移到表达培养基中,蛋白的生产效率会比较高。这为在实验室开展人胰岛素基因在酿酒酵母中的表达研究奠定了技术基础。为了进一步对BJ5457酵母转化株表达的人胰岛素进行定量分析,我们对其进行免疫印迹分析,同时与胰岛素注射液、小鼠胰腺蛋白提取物作对比,确定酵母表达的胰岛素的免疫反应性。