子痫前期（preeclampsia，PE）是发生于妊娠20周后的常见并发症，主要表现为母体综合征，包括高血压、蛋白尿，伴或不伴多器官系统损伤；有时可伴有胎儿综合征，包括胎儿宫内生长受限、胎儿窘迫及羊水过少等，其发病率为2-8％，是产科中导致是母儿发病率和死亡率的主要原因。目前子痫前期的切确发病机制仍不清楚，大量证据显示子痫前期存在过度炎性反应，炎性介质的表达上调在子痫前期的发病机制中起着重要作用。　　新近研究发现α7烟碱型乙酰胆碱能受体（α7nAChR）介导“胆碱能抗炎通路”（CAP）调控抑制了炎性因子的释放，参与了炎性机制的调控。该通路是由迷走神经及其递质乙酰胆碱和胆碱能受体构成的。研究表明，刺激迷走神经或应用α7nAChR激动剂，可激活胆碱能抗炎通路，通过NF-κB信号通路抑制多种全身性炎症性疾病中的TNF-α，IL-1β，IL-6和HMGBI等的生成和释放。本课题组前期研究发现α7nAChR激动剂（烟碱）可能介入妊娠病理变化。　　因此，我们设想调节“胆碱能抗炎通路”可能对子痫前期的防治起到了一定作用。本研究通过α7nAChR激动剂/拮抗剂干预子痫前期动物模型，探讨胆碱能抗炎通路对子痫前期的影响，为防治子痫前期提供新的靶点。　　第一部分α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂烟碱对子痫前期动物模型干预效果的评价　　【目的】　　使用极低剂量内毒素建立子痫前期孕鼠模型，从血压、尿蛋白及子代结局等方面评价α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂烟碱对子痫前期孕鼠的干预效果。　　【材料与方法】　　1、实验动物及分组：　　（1）实验动物：实验动物购于广东省医学实验动物中心，为SPF级，8-10周龄，SD雌性大鼠（约200-240g），经隔离检疫并适应性喂养一周，按雌雄大鼠2:1进行合笼后，次晨行阴道涂片，在镜检下发现精子则标记为妊娠第0天；　　（2）实验分组：57只大鼠随机分为7组　　（1）正常非孕对照组（NP，n=7）；　　（2）正常妊娠对照组（P，n=8）；　　（3）正常妊娠+烟碱处理组（P+Nic，n=8)；　　（4）正常妊娠+α-银环蛇毒素处理组（P+α-BGT，n=7)；　　（5）子痫前期模型组（PE，n=10）；　　（6）子痫前期+烟碱处理组（PE+Nic，n=10）；　　（7）子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组（PE+α-BGT+Nic，n=7）。　　2、给药方法：　　（1）建立子痫前期的模型：根据Faas等人先前报道的实验方法，使用极低剂量内毒素（l.0 ug/kg体重），并用生理盐水溶解配制稀释为2ml，在大鼠妊娠第14天使用微量注射泵由尾静脉缓慢泵入内毒素；其它对照组给予等量生理盐水2ml尾静脉注射。　　（2）α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂烟碱/拮抗剂α-银环蛇毒素的干预妊娠第14天开始皮下注射烟碱（1mg/kg/d）或α-银环蛇毒素（1ug/kg/d）及生理盐水至妊娠第19天。其中烟碱每天分两次注射（9:00AM；3:00PM），而α-银环蛇毒素则在注射烟碱前半小时进行皮下注射。　　3、评估指标：　　（1）大鼠动脉收缩压测量：在大鼠妊娠第6、11、14、16、18天的上午9:00-12:00之间，采用无创尾套法测量各组大鼠血压。　　（2）大鼠24小时尿蛋白的检测：在大鼠妊娠第7、12、17、19天使用代谢笼收集各组大鼠24小时尿蛋白。　　（3）大鼠肝肾功能检测：在大鼠妊娠第20天麻醉大鼠，取下腔静脉血，离心后收集血清，采用全自动生化分析仪检测大鼠血清谷丙氨酸转氨酶（ALT）、谷草氨酸转氨酶（AST）、肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）的水平。　　（4）妊娠结局：妊娠第20天终止妊娠，剖宫术取出仔鼠及胎盘并进行计数称重，吸收胚胎以及畸形胎儿个数均被记录，并对结果进行统计分析。　　4、统计学分析：所有数据采用均数±标准误( x±s)表示，P<0.05表示差异有统计学意义。各组间采用方差分析(ANOVA)进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。血压、尿蛋白指标采用重复测量的方差分析；卡方检验或Fisher精确概率检验用于率的比较。在进行方差分析前，采用S-W方法进行正态性检验。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。　　【结果】　　1、烟碱降低子痫前期大鼠动脉收缩压（SBP）：妊娠第14天内毒素注射后第二天血压明显升高，烟碱皮下注射后，妊娠第16天、第18天烟碱处理子痫前期组较子痫前期模型组血压下降（112.4±3.6 VS124.6±4.1mmHg，112.6±4.5 VS127.8±3mmHg，P<0.01）；α-银环蛇毒素逆转了烟碱在子痫前期中的作用，在子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组中，妊娠第16天、第18天血压较子痫前期+烟碱处理组明显升高（124.8±4.2 VS112.4±3.6 mmHg，125.9±4 VS112.6±4.5mmHg，P<0.01），而与子痫前期组血压差异无统计学意义。内毒素注射前各组大鼠基础血压无显著性差异（P>0.05）。　　2、烟碱降低子痫前期大鼠24小时尿蛋白浓度：内毒素注射后，妊娠第17、19天子痫前期模型组尿蛋白含量明显升高（第17天，4.215±0.145 mg，P<0.05；第19天，4.096±0.164 mg，P<0.05），烟碱处理子痫前期组尿蛋白较子痫前期模型组明显降低（第17天，3.376±0.194 mg，P<0.05；第19天，2.760±0.119 mg，P<0.01）。α-银环蛇毒素作用后逆转了烟碱的作用，在子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组升高了尿蛋白浓度（第17天，4.011±0.266mg， P<0.05；第19天，4.024±0.195 mg，P<0.01）。　　3、大鼠肝肾功能指标：各组大鼠临床生化指标（ALT、AST、 SCr、 BUN）之间差异在内毒素注射前后均无统计学意义。　　4、烟碱改善子痫前期大鼠妊娠结局：妊娠第20天，子痫前期模型组与对照组比较明显降低了胎儿体重（P<0.01），而烟碱干预后明显改善了子痫前期大鼠的胎儿体重（P<0.01）。α-银环蛇毒素作用后逆转了烟碱的作用，子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组较其余各组胎儿重量均下降（P<0.05），而与子痫前期模型组差异无显著性意义。各组间胚胎吸收率、存活胎儿数、胎盘重量差异无统计学意义（P>0.05）。　　【结论】　　1、成功建立了子痫前期大鼠模型。　　2、α7nAChR激动剂烟碱可有效改善大鼠子痫前期样症状，及改善胎儿体重。　　3、α7nAChR拮抗剂α-银环蛇毒素可逆转烟碱的保护效应。　　第二部分α7烟碱型乙酰胆碱受体激动剂烟碱在子痫前期中的抗炎作用研究　　【目的】　　在子痫前期动物模型基础上，使用多功能液相芯片分析技术(Luminex)检测外周血及胎盘组织中炎性因子含量，比较α7nAChR激动剂烟碱干预前后各组细胞因子水平变化情况，探讨胆碱能抗炎通路在子痫前期中的抗炎作用。　　【材料与方法】　　1、实验动物及分组：　　（1）实验动物：具体条件如第一部分所述。　　（2）实验分组：具体条件如第一部分所述。　　2、给药方法：具体条件如第一部分所述。　　3、标本留取：妊娠第20天麻醉处死大鼠，处死前留取外周血，离心后血清备用，剖宫取出胎盘，随机选取一部分迅速置于液氮中，然后转入-80度保存。　　4、炎性指标检测：Luminex实验方法检测大鼠血清和胎盘中炎性因子TNF-α,， IFN-γ，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-10和IL-17A的表达水平。　　5、统计学分析：所有数据采用均数±标准误( x±s)表示，P<0.05表示差异有统计学意义。各组间采用方差分析(ANOVA)进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。在进行方差分析前，采用S-W方法进行正态性检验。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。　　【结果】　　1、烟碱降低子痫前期大鼠血清炎性因子水平：子痫前期模型组血清炎性因子IL-6，TNF-α，IFN-γ和IL-1β较正常妊娠组，非孕对照组，正常妊娠+烟碱处理组明显升高（P<0.05）；子痫前期+烟碱处理组血清IL-6，TNF-α，IFN-γ和IL-1β明显降低（P<0.05）；α-银环蛇毒素处理后逆转了烟碱的作用，在子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组血清中IL-6，TNF-α，IFN-γ和IL-1β较其它各组明显升高，而与子痫前期组差异无统计学意义；其中正常妊娠+烟碱处理组IL-6，TNF-α，IFN-γ较其它各组降低；各组间大鼠血清炎性因子IL-2，IL-10，IL-17A差异差异无明显统计学意义（P>0.05）。　　2、烟碱降低子痫前期大鼠胎盘炎性因子水平：子痫前期模型组胎盘炎性因子IL-6，TNF-α，IL-17A和IL-1β较正常妊娠组，非孕对照组，正常妊娠+烟碱处理组明显升高（P<0.05），而在子痫前期+烟碱处理组胎盘IL-6，TNF-α， IL-17A和IL-1β明显降低（P<0.05）；α-银环蛇毒素处理后逆转了烟碱的作用，在子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组中胎盘炎性因子IL-6，TNF-α，IL-17A和IL-1β较正常妊娠组，正常妊娠+烟碱处理组明显升高，差异具有统计学意义（P<0.05）；而烟碱处理组较子痫前期组IL-6，TNF-α，IL-17A和IL-1β明显降低（P<0.05）；各组间大鼠胎盘炎性因子IL-2，IL-10和IFN-γ差异无明显统计学意义（P>0.05）。　　【结论】　　1、α7nAChR激动剂烟碱抑制了子痫前期大鼠的全身性和胎盘的过度炎性反应。　　2、α7nAChR拮抗剂α-银环蛇毒素逆转了烟碱在子痫前期大鼠中的抗炎作用，表明烟碱抑制子痫前期大鼠的炎性反应可能是通过α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路完成的。　　第三部分α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）和NF-κB信号通路在子痫前期大鼠胎盘组织中的研究　　【目的】　　α7烟碱型乙酰胆碱受体（α7nAChR）在胆碱能抗炎通路中起到重要作用，是此通路的主要成分，参与炎症调节，通过Western blot方法、荧光定量 PCR方法研究α7nAChR在子痫前期模型鼠胎盘组织中的表达情况，利用免疫组化法检测NF-κB p65在胎盘组织中的变化，探讨胆碱能抗炎通路在子痫前期发病中可能的作用机制。　　【材料与方法】　　1、实验动物：具体条件如第一部分所述。　　2、实验分组：50只大鼠随机分为6组，　　（1）正常妊娠对照组（P，n=8）；　　（2）正常妊娠+烟碱处理组（P+Nic，n=8)；　　（3）正常妊娠+α-银环蛇毒素处理组（P+α-BGT，n=7)；　　（4）子痫前期模型组（PE，n=10）；　　（5）子痫前期+烟碱处理组（PE+Nic，n=10）；　　（6）子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组（PE+α-BGT+Nic，n=7）。　　2、子痫前期动物模型建立及给药方法：具体条件如第一部分所述。　　3、取材：妊娠第20日麻醉实验大鼠，行剖宫产，随机取得胎盘组织，迅速放入液氮快速冷冻，随后转入-80℃冰箱保存备用；另取胎盘放入中性福尔马林固定用于制作蜡块。　　4、检测方法：采用荧光定量PCR法检测胎盘组织中α7nAChR的表达，采用相对定量方法比较经过处理的样品和未经处理的样品或内参样品目标转录本之间的表达差异。Western blot法检测α7nAChR在胎盘组织中的表达，用Quantity One软件对蛋白免疫印迹条带进行分析，比较目的条带和内参条带灰度值的比值并。免疫组化对NF-κB p65蛋白在胎盘组织中进行定位及半定量检测。　　5、统计学分析：所有数据采用均数±标准误( x±s)表示，P<0.05表示差异有统计学意义，计数资料用百分数表示。各组间采用方差分析(ANOVA)进行比较，方差齐性采用最小显著性差异检验（LSD），方差不齐时采用Dunnett’s T3检验。在进行方差分析前，采用S-W方法进行正态性检验。采用SPSS13.0软件进行统计学分析。　　【结果】　　1、烟碱增加了胎盘α7nAChR mRNA的表达：RT-PCR相对定量结果提示在正常妊娠+烟碱处理组与子痫前期+烟碱处理组胎盘组织中α7nAChR mRNA的表达较其余各组明显升高（P<0.001；P<0.01），而α-银环蛇毒素逆转了烟碱在子痫前期中的作用，子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组胎盘组织中α7nAChR mRNA的表达较子痫前期+烟碱处理组明显降低，其余各组胎盘α7nAChR mRNA表达量无明显差异（P>0.05）。　　2、烟碱增加了胎盘α7nAChR蛋白的表达：Western-blot灰度比值分析结果提示正常妊娠+烟碱处理组与子痫前期+烟碱处理组胎盘组织中α7nAChR蛋白的表达较其余各组明显升高（P<0.05； P<0.05），而α-银环蛇毒素逆转了烟碱在子痫前期中的作用，子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组胎盘组织中α7nAChR蛋白的表达较子痫前期+烟碱处理组明显降低，其余各组α7nAChR蛋白表达量无明显差异（P>0.05）。　　3、烟碱降低了大鼠胎盘组织中内毒素诱导的NF-κB p65的表达：NF-κB p65免疫组化结果显示阳性染色呈棕褐或棕黄色，分布于胎盘迷路区的滋养层细胞。子痫前期模型组胎盘NF-κB p65的表达较其余各组明显增多（P<0.001），子痫前期+烟碱处理组胎盘NF-κB p65的表达明显降低，而α-银环蛇毒素逆转了烟碱在子痫前期大鼠胎盘中的作用，在子痫前期+α-银环蛇毒素+烟碱处理组胎盘中NF-κB p65的表达明显增多（P<0.05）。其余各组NF-κB p65的表达无明显差异（P>0.05）。　　【结论】　　烟碱可使子痫前期大鼠胎盘中炎性反应降低，α7nAChR表达上调，这一过程可能通过α7nAChR介导的胆碱能抗炎通路抑制NF-κB途径完成。