(-)-羟基柠檬酸[(-)-Hydroxycitric Acid,(-)-HCA],来自藤黄果植物的果壳中。柠檬酸裂解酶优先和(-)-HCA结合,能竞争性地抑制柠檬酸裂解酶的活性,降低脂肪酸并且抑制腹部脂肪沉积。(-)-HCA因其独特的生物学功能引起了广泛的关注,然而有关(-)-HCA生物功能的研究主要集中人或啮齿动物。关于(-)-HCA在畜牧生产中的应用,特别是对家禽脂肪代谢的影响几乎没有报道。本研究以罗氏308肉鸡为研究对象,在探讨(-)-HCA对肉鸡血清中与脂肪代谢相关的生理生化指标、参与脂肪代谢的关键因子mRNA表达和瘦素等与脂代谢相关激素含量影响的基础之上,利用以GC-MS为核心的代谢组学技术,分析(-)-HCA调节后肉鸡血清差异代谢产物的变化;利用以2-DE为核心技术的蛋白质组学的方法,构建肉鸡肝脏线粒体和胞浆蛋白表达的精细图谱,利用生物信息学的方法结合代谢组学技术筛选的差异代谢产物,鉴定(-)-HCA调控肉鸡脂肪代谢关键途径的主要效应蛋白因子。本研究的目的是阐明(-)-HCA对家禽脂肪代谢的影响机制,为(-)-羟基柠檬酸在动物生产中如何应用,给予理论支持,也为生物体营养物质的分配提供新的研究思路。1日粮中添加不同剂量的(-)-羟基柠檬酸对肉鸡脂肪代谢的影响为探讨(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]对肉鸡脂肪代谢的影响,120羽21日龄罗氏308肉鸡随机分成4组。在基础日粮中添加0,1000,2000和3000mg/Kg的(-)-HCA。饲喂至49日龄,每组选取12只鸡屠宰,采集样品冷冻。测定血清中脂肪代谢相关生化指标:甘油三酯TG、总胆固醇(TC)、非酯化脂肪酸(NEFA)低密度脂蛋白胆固醇LDL-C、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)的含量;检测肝脏脂肪代谢相关生化指标:TG、NEFA、肝糖原(Glycogen)的含量和肝酯酶(HL)的活性;检测血清中瘦素(Leptin)、胰岛素(Insulin)、胰高血糖素(Glucagon)、游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)、游离四碘甲状腺原氨酸(FT4)、三碘甲状腺原氨酸(T3)和四碘甲状腺原氨酸(T4)的含量;测定肝脏组织参与脂肪合成代谢关键因子:固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、脂肪酸合酶(FAS)、柠檬酸裂解酶(ACLY)基因的mRNA表达水平;检测肝脏组织中脂肪分解代谢关键因子:肉碱棕榈酰转移酶-Ⅰ(CPT-Ⅰ)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPAR-α)基因的mRNA表达水平。检测肝脏组织中脂代谢关键因子AMPK(AMP依赖的蛋白激酶)基因的mRNA表达水平。试验结果显示,与对照组相比,中剂量组和高剂量组的(-)-HCA可显著降低肉鸡的日增重;腹脂率与对照组相比无统计学上的显著差异,但不同剂量(-)-HCA处理可使肉鸡的腹脂率分别降低了5.7%、2.4%和2.4%;不同剂量(-)-HCA处理后肉鸡胸肌和腿肌的相对重量与对照组相比无显著性变化。不同剂量的(-)-HCA处理可显著降低血清和肝脏中TG含量,且高剂量的(-)-HCA处理可显著降低血清和肝脏组织中肝油三酯的含量。中、高剂量(-)-HCA处理能显著提升肝脏中NEFA、糖原的含量并提高肝脂酶的活性,且高剂量组的T4和FT3含量相比于对照组显著升高,而低剂量组能显著升高leptin含量。不同剂量的(-)-HCA处理均可显著降低肉鸡肝脏组织中脂肪酸合成酶(FAS)和固醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)的mRNA表达水平;高剂量(-)-HCA处理可显著降低柠檬酸裂解酶(ACLY)的mRNA表达水平;中、高剂量的(-)-HCA处理可显著提高过氧化物增殖体激活受体α(PPARα)的mRNA表达水平,但不同剂量的(-)-HCA处理对乙酰辅酶A羧化酶(ACC)和肉碱棕榈酰转移酶-1(CPT-1)的mRNA表达水平均无显著影响。对不同亚型的AMP依赖性的蛋白激酶(AMPK)分析结果表明,不同剂量的(-)-HCA处理均可显著提高肉鸡肝脏组织AMPKβ2的mRNA表达水平。结果提示,(-)-HCA可能主要是通过降低脂肪酸合成基因FAS、SREBP-1c和ACLY的表达而抑制脂肪酸的合成,从而降低甘油三酯的合成,最终减少肉鸡腹脂的沉积。2(-)-羟基柠檬酸调节肉鸡血清差异代谢产物的筛选及关键代谢途径分析本试验选取罗氏308肉鸡为研究对象,分析(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]调控后肉鸡血清代谢中间或终产物的变化,并利用生物信息学的方法分析(-)-HCA调节机体代谢的关键代谢途径。试验设计同第一章。试验采用硅烷化试剂处理肉鸡血清,利用气相色谱质谱(GC/MS)联用,采集图谱,对图谱进行数据库对比,鉴定化合物。采用SIMCA-P11软件对数据进行分析,通过主成分分析(PCA)、偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型评价三组异同点,找出差异化合物。试验结果表明,在不同处理组间共检测到了114种化合物,其中97种化合物得到了鉴定,17种化合物未能鉴定。对四个不同处理组样品采用PCA模型进行主成分分析,发现低、中、高3个剂量(-)-HCA处理均使得代谢模式图出现规律变化,3个剂量(-)-HCA处理与对照组相比均能引起明显的差异;不同剂量处理间比较发现,低剂量与高剂量处理间有明显差异,但中剂量处理组与低剂量处理组间差异并不显著。对差异代谢产物进行鉴定,发现低剂量(-)-HCA处理苹果酸、柠檬酸、葡萄糖水平上升,乳酸和尿酸明显降低,提示(-)-HCA能加速三羧酸循环,增加机体能量代谢,同时加快糖异生。发现高剂量(-)-HCA处理组可显著降低肉鸡血清中亚油酸、硬脂酸、棕榈酸的含量。提示(-)-HCA处理可显著抑制肉鸡脂肪酸的合成,这与脂代谢关键酶表达的检测结果相吻合。采用Pathway enrichment对差异代谢产物进行了初步的代谢通路分析,发现(-)-HCA处理主要影响机体苹果酸-天冬氨酸穿梭、氨代谢、尿素循环、亚油酸代谢、谷胱甘肽代谢、糖异生等途径。3(-)-羟基柠檬酸调控肉鸡脂肪代谢主要效应蛋白的筛选和鉴定本试验选取罗氏308肉鸡为研究对象,研究(-)-羟基柠檬酸[(-)-HCA]构建肉鸡肝脏线粒体和胞浆蛋白/酶表达谱,进而筛选出(-)-HCA调节肉鸡脂肪代谢关键代谢途径的效应蛋白因子。在肉鸡肝脏线粒体蛋白中,与对照组相比,低剂量处理中发现21个差异蛋白,中剂量处理中发现27个差异蛋白,高剂量处理组中发现17个差异蛋白;在肉鸡肝脏胞浆蛋白中,与对照组相比,低剂量组有17个差异蛋白点,中剂量组有17个差异蛋白点,高剂量组有12个差异蛋白点。试验结果表明,(-)-HCA通过上调线粒体中AC02的表达,催化柠檬酸氧化成异柠檬酸,提高三羧酸循环效率,加强机体能量代谢,减轻肉鸡体重。下调ME1表达量,减少其产生用于脂肪酸合成的辅酶NADPH,减小脂肪酸合成速率。(-)-HCA通过上调PDHc的表达量,加速三羧酸循环,提高能量代谢。