睡眠剥夺(sleep deprivation,SD)是指环境改变(如严寒、高温、噪声等),或其他不可抗因素(如工作压力过大或作战状态等)导致睡眠无法满足正常生理需求(24h睡眠少于4h),从而引起如运动能力、记忆能力、免疫能力下降等一系列人体生理、心理、行为等变化的情况。湿热环境指气温在29℃以上,空气相对湿度超过60%的高温高湿环境。高温高湿环境下,人体同时承受来自外部的传导热量和机体内部产生的热量,且由于蒸发散热能力下降,蓄积了过多热量,导致组织器官损伤和功能下降,出现水盐代谢失调,机体内部稳态失衡,从而引起体力与脑力疲劳的产生。目前,对睡眠剥夺或湿热环境单一条件导致的重要脏器影响的研究报道较多,但对湿热环境合并睡眠剥夺双重应激下所导致疲劳的发生、发展和机体重要脏器损害机制及保护措施的研究未见报道,也缺乏简便有效的抗疲劳和快速恢复疲劳的有效药物。对于湿热地区睡眠剥夺作业疲劳的预防和快速恢复的研究对提高部队战斗力有重要作用,这也是军事医学急待解决的问题。为此,以我们以前研究的抗疲劳配方杞藿饮作为抓手,探索该配方在解决上述问题中的可行性、有效性。杞藿饮(Qi Huo Decoction,QHD)由黄芪、红景天、枸杞子、淫羊藿、刺五加、马齿苋、绞股蓝等组成,具有益气滋阴、补精养神、清湿热、强筋骨等功效。我们以往的研究显示,该药在抗运动力竭疲劳方面有一定作用。本实验观察杞藿饮对湿热环境下睡眠剥夺大鼠疲劳产生过程中重要脏器的保护作用,并探讨其机制为中药制剂杞藿饮成为抵抗疲劳发生和加快恢复的新型药物奠定动物实验基础。【研究目的】以SD大鼠为实验对象,观察杞藿饮对湿热环境下睡眠剥夺疲劳大鼠肝、胃、骨骼肌等重要脏器的保护作用,探讨杞藿饮作为抗疲劳遴选制剂的可行性。【研究方法】40只雄性SD大鼠,我们应用随机数字表法将其分为四组,分别为空白对照(BC)组、湿热环境对照(HC)组、湿热环境睡眠剥夺(HS)组、湿热环境睡眠剥夺QHD(HSQ)组,各组均为10只。BC组实验大鼠在常温常湿环境下喂养,HC组、HS组、HSQ组大鼠模拟湿热环境下饲养。BC组、HC组、HS组实验大鼠,给予每日2次蒸馏水3ml灌胃,HSQ组实验大鼠给予每日2次QHD(含生药1g/mL)灌胃,连续15d。HS组、HSQ组大鼠,予以72h睡眠剥夺。72h实验结束后对实验大鼠肝、胃、骨骼肌的损害程度进行检测比较,主要检测的指标包括:1.检测大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)水平,肝组织中肝糖元、丙二醛(MDA)和还原型谷胱甘肽(GSH)水平。比较各组大鼠β-半乳糖苷酶(β-gal)在肝细胞中的表达及其超微结构变化。2.HE染色观察各组大鼠胃黏膜组织病理学改变,H~+/K~+-ATP酶荧光染色测定各组大鼠胃黏膜分泌期壁细胞计数值。3.检测大鼠腓肠肌组织中肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)水平及其超微结构变化。【结果】1.肝脏保护作用观察:⑴与BC组比较,HC组、HS组、HSQ组血清AST和ALT均显著升高(P<0.01);HS组、HSQ组血清AST和ALT较HC组均显著升高(P<0.01);HSQ组血清AST和ALT明显低于HS组(P<0.01)。说明长期处于湿热环境可以对实验大鼠肝功能造成损伤,连续睡眠剥夺加剧了损伤程度,而杞藿饮能有效减轻其损伤程度。⑵与BC组比较,HC组、HS组、HSQ组肝组织中肝糖元和GSH含量显著降低(P<0.05),MDA含量显著增高(P<0.01)。与HC组比较,HS组、HSQ组肝糖元和GSH含量显著降低(P<0.01),MDA含量显著增高(P<0.01)。与HS组比较,HSQ组肝糖元和GSH含量显著增高(P<0.01),MDA含量显著降低(P<0.01)。说明长期处于湿热环境可以减少实验大鼠肝糖原储备,并造成机体氧化应激失衡,导致肝脏损害且减缓恢复,连续睡眠剥夺加剧了此过程,而杞藿饮可以增加肝糖原的储备,进而可以维持血液中血糖稳定,提供更多能量,并能调节氧化应激平衡,减轻肝脏的损害,并加速恢复,维护肝细胞的正常功能。⑶光镜下HC组、HS组、HSQ组实验大鼠肝组织均有不同程度的炎性细胞浸润,肝细胞肿胀坏死,以HS组最明显,HSQ组损害有一定程度的减轻。说明长期处于湿热环境及睡眠剥夺导致实验大鼠肝组织炎性坏死,而杞藿饮能明显减轻此情况。⑷HC组、HS组、HSQ组大鼠肝细胞均有衰老相关β-gal阳性表达。HC组、HS组、HSQ组大鼠的肝组织中β-gal阳性细胞计数值均显著高于BC组大鼠(P<0.01),HS组、HSQ组β-gal阳性细胞计数值均显著高于HC组大鼠(P<0.01),HSQ组β-gal阳性细胞计数值显著低于HS组(P<0.01)。说明长期处于湿热环境可加快肝细胞的衰老进程,连续睡眠剥夺更加速了此进程,而杞藿饮能抑制肝细胞衰老,从而降低肝细胞损害。⑸透射电镜观察显示HC组、HS组、HSQ组实验大鼠肝细胞的微绒毛减少,有的甚至消失,部分肝细胞出现了空泡化,损伤以HS组大鼠最明显,HSQ组损害有一定程度的减轻。说明长期处于湿热环境可对实验大鼠肝细胞超微结构造成损伤,连续睡眠剥夺更加剧了损伤程度,而杞藿饮能有效减轻其损伤。2.胃黏膜保护作用观察:⑴HC组、HS组、HSQ组实验大鼠的胃黏膜均有不同程度的损伤。其表现为胃黏膜散在多量点状/线状的糜烂充血,上面附盖有小量血痂,可以看到炎性细胞浸润。HSQ组实验大鼠的胃黏膜损伤程度明显轻于HS组大鼠。说明长期处于湿热环境下,可导致实验大鼠胃黏膜损伤,连续睡眠剥夺可使损伤明显加重,而杞藿饮能明显减轻胃黏膜损伤程度。⑵与BC组比较,HC组、HS组、HSQ组大鼠胃分泌期壁细胞计数显著升高(P<0.05),HS组、HSQ组大鼠胃分泌期壁细胞计数显著高于HC组(P<0.01),HSQ组大鼠胃分泌期壁细胞计数显著低于HS组(P<0.01)。从细胞学水平证明胃酸在长期湿热环境下连续睡眠剥夺引起的应激性胃黏膜损害形成中起重要作用,而杞藿饮能减少壁细胞进入分泌期,进而抑制胃酸分泌,从而降低大鼠的胃黏膜损害程度。3.骨骼肌保护作用观察:⑴与BC组比较,HC组、HS组、HSQ组大鼠腓肠肌中CK和LDH水平均显著升高(P<0.05),NO和iNOS水平显著降低(P<0.05)。与HC组比较,HS组、HSQ组大鼠腓肠肌CK和LDH水平显著升高(P<0.01),NO和iNOS明显降低(P<0.01)。与HS组比较,HSQ组大鼠腓肠肌CK和LDH水平无明显差异(P>0.05),NO和iNOS水平明显升高(P<0.01)。说明长期处于湿热环境及连续睡眠剥夺可致大鼠骨骼肌能量代谢障碍,自由基水平失调。而杞藿饮可以明显改善肌细胞的能量代谢,调节自由基水平平衡,增强机体抗氧化效能。湿热环境睡眠剥夺(HS)组和湿热环境睡眠剥夺杞藿饮(HSQ)组间CK和LDH水平无显著性差异,可能与实验设置湿热环境比较温和,睡眠剥夺对骨骼肌细胞的损伤程度较轻及实验样本过少有关。⑵透射电镜观察显示,BC组、HC组大鼠腓肠肌纤维肌节清晰,长短大体一致,明暗带分界清楚,排列规则。HS组、HSQ组大鼠均出现不同程度的腓肠肌纤维轻度的溶解、明暗带之间分界模糊,排列不规律等改变,尤以HS组的超微结构变化最显著。说明长期湿热环境及连续睡眠剥夺可以导致骨骼肌超微结构破坏,而杞藿饮能一定程度减轻骨骼肌损伤程度。【结论】以上研究证实:高温高湿环境可导致SD大鼠肝、胃、骨骼肌一定程度的损伤;连续睡眠剥夺能增加其损伤程度;杞藿饮可显著改善实验大鼠肝脏、胃、骨骼肌的损伤程度。杞藿饮对湿热环境下睡眠剥夺导致疲劳大鼠的肝、胃、骨骼肌具有保护作用,可以作为疲劳预防和快速恢复的遴选中药制剂。