本文分为以下两个部分进行探讨：　　第一部分 活性氧及其所致钙振荡在肺动脉内皮细胞基因表达调控中的作用　　越来越多的证据显示，活性氧(reactive oxygen species，ROS)在细胞内似乎与Ca2+，cAMP, IP3， NO等类似，可起到第二信使作用，但对其如何引起细胞内信号转导和基因表达的机制，仍知之甚少。H2O2是活性氧中相对较稳定且具良好的弥散性能的一种，已知外源性H2O2可刺激内皮细胞发生钙振荡，而膜受体刺激所致的生物性钙振荡已被证实可参与调节和优化基因的表达，对于H2O2这种非受体刺激及其引起的生物性钙振荡是否也能调节基因的表达，以及如何调节等问题，即是本研究目的之所在。　　在培养的猪肺动脉内皮细胞上，分别用1，10，50，100，200，500μmol/L外源性过氧化氢(H2O2)处理细胞30min，CCK-8法检测细胞活力;钙离子荧光成像系统检测单个肺动脉内皮细胞胞浆游离钙的变化;基于ELISA的转录因子活性测定方法检测转录因子核因子kappaB(nuclear factor of kappaB，NF-κ B)、缺氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1，HIF-1)、激活蛋白1(activatorprotein1，AP-1)的转录活性;逆转录PCR(RT-PCR)检测eNOSmRNA水平;蛋白免疫印迹(Westernblotting)检测诱导性一氧化氮合酶(inducible nitric oxidesynthase，iNOS)，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)蛋白表达的水平;在“胞浆钙离子浓度被钳制”后，检测100μmol/L H2O2引起NF-κB、HIF-1、AP-1活性的变化。　　结果:(1)1，10，50μmol/L H2O2对肺动脉内皮细胞活力无明显影响，100，200，500μmol/L H2O2均可对肺动脉内皮细胞活力有明显抑制作用，细胞存活率分别为81％，65％，31％;(2)1，10，50μmol/L H2O2对细胞胞浆游离钙水平无显著影响，100，200，500μ mol/L H2O2可引起肺动脉内皮细胞发生钙振荡，频率呈浓度依赖性递增。(3)对于NF-κB，1，10μmol/L H2O2可引起NF-κB特异性结合活性呈浓度依赖性递增，非特异性结合活性保持不变。50，100，200，500μmol/L H2O2可引起NF-κ B特异性结合活性和非特异性结合活性均呈浓度依赖性递减趋势，但二者的比值先呈上升趋势，至100μ mol/L时达高峰，随后又下降。对于HIF-1，1，10，50μ mol/L H2O2可引起HIF-1特异性结合活性呈浓度依赖性递增，非特异性结合活性在1，10μ mol/L浓度保持不变，至50μ mol/L开始下降;100，200，500μ mol/L H2O2可引起HIF-1特异性结合活性和非特异性结合活性均呈浓度依赖性递减趋势，二者的比值也呈下降趋势。对于AP-1，1，10μ mol/L H2O2对NF-κ B特异性结合活性和非特异性结合活性均无明显影响。50，100，200，500μ mol/L H2O2可引起NF-κ B特异性结合活性和非特异性结合活性均呈浓度依赖性递减趋势，但二者的比值先呈上升趋势，至100μ mol/L时达高峰，随后又下降。(4) eNOS mRNA水平的变化趋势与AP-1转录活性的变化趋势一致。因猪iNOS，VEGF基因序列未见报道，针对人iNOS，VEGF基因序列设计的引物未能扩增出iNOS，VEGF基因目的片断;(5)iNOS，VEGF，eNOS蛋白表达的水平分别与NF-κ B、HIF-1、AP-1转录活性的变化趋势一致。(6)胞浆“钙离子浓度被钳制”的肺动脉内皮细胞NF-κB、HIF-1、AP-1特异性转录活性及非特异性结合活性的基础值并无显著性差异;与胞内“钙离子浓度未被钳制”的肺动脉内皮细胞相比，100μmol/LH2O2刺激“钙离子浓度被钳制”细胞NF-κ B、AP-1与其特异性探针结合活性明显降低，HIF-1与其特异性探针结合活性明显升高，而与非特异性探针结合活性的变化无显著差异。　　由于转录因子的特异性结合活性是由激活的转录因子的浓度和其与DNA的亲和力两个因素的乘积组成，而非特异性结合活性则只取决于转录因子蛋白的总浓度和其与DNA的亲和力，而与转录因子蛋白是否激活无关，因此二者的比值就可以反映激活转录因子蛋白从非活性状态向活性状态转换的因素的强弱。低浓度外源性H2O2可在不引起肺动脉内皮细胞胞浆钙离子水平明显变化的情况下发挥信号转导作用，激活NF-κ B、HIF-1，而不影响AP-1活性;较高浓度剂量(100，200，500μ mol/L)外源性H2O2引起NF-κ B，HIF-1，AP-1转录活性均下降，这种作用可能主要是由于此浓度范围H2O2对NF-κ B，HIF-1，AP-1与顺式作用元件（启动子、增强子）的亲和力的直接抑制造成的，此浓度范围的H2O2刺激的细胞胞浆游离钙振荡的发生可部分缓冲NF-κ B，AP-1转录活性的下降，而促进HIF-1转录活性的下降。　　第二部分 组胺所致钙信号在肺动脉内皮细胞和气道上皮细胞病理反应中的变化　　缺氧性肺血管收缩(hypoxic pulmonary vasoconstriction，HPV)和气道高反应性(airway hyperresponsiveness，AHR)是呼吸系统疾病（慢阻肺，哮喘等）所致的两个最常见的病理反应。肺动脉内皮细胞和气道上皮细胞分别在这两个病理反应中发挥重要的旁分泌调节作用。肺内肥大细胞和嗜碱性粒细胞释放的组胺则是刺激这两种细胞发生相关反应的最重要介质之一。一定浓度范围的组胺可引起肺动脉内皮细胞和气道上皮细胞胞浆游离钙信号的改变，其中可表现为钙振荡。钙振荡可以频率解码的形式调节基因的表达，钙振荡的频率可以作为细胞对刺激反应强弱的一个指标。为探索持续缺氧的肺动脉内皮细胞以及经抗原致敏的气道上皮细胞对组胺的反应的改变，分别测定了组胺引起的钙信号在此两个病理反应中的变化，并对其机制或效应进行了初步探讨。分为如下两小部分:　　（一）缺氧对组胺所致肺动脉内皮细胞钙振荡频率的影响　　钙振荡(calcium oscillation)能以频率解码的形式调节基因转录，钙振荡的频率可反映基因转录的水平。为探索缺氧在肺动脉内皮细胞对组胺反应的影响，研究了24小时轻度缺氧对组胺所致肺动脉内皮细胞钙振荡频率的影响，并探索其机制。结果是:(1)24小时轻度缺氧可显著增加组胺刺激的肺动脉内皮细胞钙振荡频率;(2) NADPH氧化酶抑制剂，Diphenylene iodonium chloride(DPI，10μmol/L)可消除组胺所致常氧和缺氧下肺动脉内皮细胞钙振荡;(3)黄嘌呤氧化酶抑制剂，别嘌呤醇(Oxypurinol，100μmol/L)能显著降低组胺刺激的缺氧后肺动脉内皮细胞升高的钙振荡频率，但降低后的钙振荡频率仍高于常氧组;别嘌呤醇对组胺刺激的常氧组肺动脉内皮细胞钙振荡频率无显著影响。以上结果表明，在持续缺氧相关的肺疾患中，肺动脉内皮细胞对组胺反应的敏感性增加。NADPH氧化酶在组胺刺激的钙振荡的发生中发挥重要作用;黄嘌呤氧化酶的激活是缺氧引起组胺所致钙振荡频率增加的重要原因。　　（二）哮喘血清对组胺所致支气管上皮细胞钙信号的影响　　哮喘的主要特征是慢性气道炎症和气道高反应性，为了探索这两方面是否与支气管上皮细胞钙信号的增敏作用有关，研究了不同浓度组胺对支气管上皮细胞内游离钙水平的影响及其对核因子-kappaB(NF-κB)活性的影响。培养的支气管上皮细胞被分成2组:S组，支气管上皮细胞与卵蛋白致敏的豚鼠血清预孵育24小时（被动致敏）;N组，支气管上皮细胞与非致敏的豚鼠血清预孵育24小时;结果是:(1)0.1μ mol/L组胺能诱发S组支气管上皮细胞钙振荡，而不能诱发N组支气管上皮细胞钙振荡;(2)1μ mol/L组胺在S组和N组支气管上皮细胞中均能诱发钙振荡，但S组支气管上皮细胞中钙振荡的频率明显高于N组;(3)10μmol/L组胺在S组和N组支气管上皮细胞中均能引起游离钙水平的快速短暂上升，随后是持续升高。S组和N组支气管上皮细胞中游离钙水平快速短暂上升的幅度没有显著性差异，而S组支气管上皮细胞中游离钙水平的随后持续升高幅度明显高于N组;(4) NF-κB活性的变化与钙振荡的频率变化趋势一致。　　由于钙振荡可以调节基因的表达，而持续钙超载可引起细胞的损伤，被动致敏的支气管上皮细胞中组胺刺激的钙信号的增强可能是导致其过度的气道损伤炎症和气道高反应性的重要机制。