I型糖尿病(type 1 diabetes mellitus,T1D)是一种自身反应性T细胞攻击自身胰岛β细胞使其受损的一种自身免疫性疾病。它主要是以效应性的CD4+T细胞和CD8+T细胞为主导,其他多种免疫细胞共同参与而形成的。NKG2D为NK细胞活化性受体,近来研究发现亦可表达于人NKT,γδT,激活的巨噬细胞,CD4+T细胞亚群,CD8+T细胞；鼠的NKT,γδT细胞亚群,激活的CD8+T细胞,CD4+T细胞亚群。有研究表明,I型糖尿病的动物模型NOD鼠的胰岛β细胞表达NKG2D的配体Rae-1,因此产生了大量表达NKG2D受体的自身反应性CD8+T、CD4+T细胞浸润在胰岛中。为进一步探讨CD4+NKG2D+T细胞参与NOD鼠T1D的发病机制,本课题对发病前驱期,发病期以及免疫干预后的NOD鼠外周血中该群细胞的表型特征、功能及活化状态进行研究。本研究内容分为三部分：第一部分：NOD鼠CD4+NKG2D+T细胞频率与Ⅰ型糖尿病疾病进程正相关目的：观察NOD鼠体内CD4+NKG2D+T细胞在Ⅰ型糖尿病疾病进程中频率变化,探索NOD鼠体内该群细胞与CD8+T细胞间关系。方法：动态监测NOD鼠(n=24)、Balb/c鼠(n=24)外周血中CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T细胞在不同周龄的频率。进而利用可有效降低血糖及发病率的偶联皂草素IGRP206-214dtSCT四聚体体内靶向清除抗原特异性清除CTL的NOD鼠(n=12),对其CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T细胞频率进行分析。将所得各个周龄CD4+NKG2D+T及CD8+NKG2D+T细胞频率做线性回归分析。结果：NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T细胞频率随着T1D疾病进程发展而显著升高。而同周龄的Balb/c鼠外周血中的CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T细胞频率几乎无变化。偶联皂草素体内特异性CTL清除的NOD鼠外周血CD4+NKG2D+/CD4+T细胞频率随着CD8+NKG2D+/CD8+T细胞频率降低而降低,并且二者之间呈正相关。结论：NOD鼠体内存在着一群与I型糖尿病相关的频率增高的CD4+NKG2D+T细胞,并且该群细胞与其体内的CD8+T细胞之间呈正相关。第二部分：NOD鼠体内CD4+NKG2D+T细胞生物学特性分析目的：分析并对比处于I型糖尿病发病前驱期以及发病期NOD鼠体内CD4+NKG2D+T细胞的功能特性、表型特征、活化状态。在体外初步探究该群细胞与CD8+T细胞之间的相互作用关系。方法：通过流式细胞术分别检测处于发病前驱期(n=18)及发病期(n=18)的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞表面CD107A、FasL、CD44、CD62L、CD69、CD25表达情况,以及胞内染色法分析IFN-γ、RORγt、IL-17A、Perforin、granzyme B、TGF-β、IL-10分泌情况。比较NOD鼠体内该群细胞处于I型糖尿病两种不同疾病阶段,CD4+NKG2D+T细胞功能、表型特点及活化状态的差异。采用磁珠分选的方法获取纯净的CD4+NKG2D+T、 CD4+NKG2D-T以及CD8+T细胞,将所得的发病前驱期NOD鼠脾脏中的CD4+NKG2D+T细胞分别与经CFSE标记的CD4+NKG2D-T细胞、CD8+T细胞共培养。4天后检测体系中的CD4+NKG2D-T细胞、CD8+T细胞CFSE的荧光强度变化情况。结果：发病期NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞IFN-γ分泌较发病前驱期无变化。RORyt的表达较发病前驱期显著上升,IL-17A的分泌水平亦升高。代表细胞毒活性的CD107A、颗粒酶B(granzyme B)和穿孔素(Perforin)均无明显变化。发病期NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞表达FasL频率较发病前驱期稍有上升但变化不明显,TGF-β和IL-10亦是稍有升高,但个体差异比较大的原因使得它们之间没有统计学意义。发病期的NOD鼠外周血中的该群细胞较CD4+NKG2D-T细胞,效应记忆性T细胞的频率较多,而中枢记忆性T细胞与CD4+NKG2D-T细胞相比则略有提升,二者之间初始T细胞频率虽稍有上升但亦无统计学差异。发病期的NOD鼠外周血中的该群细胞较CD4+NKG2D-T细胞,CD69表达频率升高,CD25表达频率亦显著上升。将磁珠分选所得的CD4+NKG2D+T和CD4+NKG2D-T细胞共培养4天,与单独的CD4+NKG2D-T细胞相比,加入CD4+NKG2D+T细胞的培养体系中,其CD4+NKG2D+T细胞的增殖加快。而CD8+T的增殖则无变化。结论：NOD鼠从I型糖尿病发病前驱期至发病期之间,其外周血中的CD4+NKG2D+T细胞不仅频率有所提高,而且该群细胞的活化程度也有一定幅度的增强,当达到发病期的时候,该群由最初的初始细胞占主导向效应记忆型细胞占主导转变,而功能上的最大改变就是,其RORyt的表达及IL-17的分泌显著提高,表明这群CD4+NKG2D+T细胞可能向CD4+NKG2D+IL-17+T细胞方向分化。在NOD鼠体内,该群CD4+NKG2D+T细胞是一群高表达IL-17,高度活化的,效应记忆型炎症性的CD4+T细胞。第三部分：过表达mlnsB15-23H-2Kd对NOD鼠CD4+NKG2D+T细胞生物学特性的影响目的：动态检测mInsB15-23H-2Kddtsct真核表达载体干预后NOD鼠体内CD4+NKG2D+T细胞频率,并对该群细胞的功能特点,表型特点,活化状态进行进一步研究。在体外探索免疫干预后的该群细胞与CD8+T细胞及CD4+NKG2D-T细胞间作用关系。方法：在NOD鼠3周龄行皮下接种mInsB15-23H-2Kd-SCT真核表达载体(n=18),以空载体(11=18)及自然NOD鼠(n=18)为对照。在4、5周龄时分别加强一次。在第三次注射后0、1、12、24、48、72h以及1、3、6、9W取小鼠外周血检测DC (CDllc+)表面H-2Kd表达情况。动态监测过表达mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+/CD4+T及CD8+NKG2D+/CD8+T细胞频率。在20W时,取过表达的NOD鼠外周血,对其CD4+NKG2D+T细胞表面CD107A、FasL、CD44、CD62L、CD69、CD25表达情况,以及胞内IFN-γ、RORγt、IL-17A、Perforin、granzyme B、TGF-β、IL-10分泌情况进行分析。并与发病前驱期、发病期NOD鼠相比较。采用磁珠分选的方法,从免疫的NOD鼠脾脏获取的纯净CD4+NKG2D+T细胞分别与经CFSE标记的纯净的CD4+NKG2D-T细胞、CD8+T细胞共培养。4天后检测体系中的CD4+NKG2D-T细胞、CD8+T细胞CFSE的荧光强度变化情况。结果：与对照组相比,在第三次注射后的0至72h以及1W之内,DC表面H-2Kd的表达均显著升高且明显高于对照组。然而在第三次注射后的3 W,DC表面H-2Kd的表达骤然降低,并持续低于对照组。CD8+NKG2D+/CD8+T细胞在6、8W时显著高于对照组,10W时二者几乎持平,12W以后一直低于对照组。在6、8、10W时,真核表达载体组CD4+NKG2D+T显著高于对照组,12W时几乎持平,14W之后一直低于对照组。过表达mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞IFN-γ分泌变化不明显：在8、10W时高于对照组,12W时与对照组几乎持平,16W以后一直保持在略低于对照组的水平。20W过表达组较未处理的发病前驱期稍有降低,但由于个体差异导致的方差较大,从而导致与发病期相比没有统计学意义。过表达mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞RORγt及IL-17A变化趋势一致。在8、10W时RORγt的表达高于对照组,12W时与对照组几乎持平,16W以后一直保持在略低于对照组的水平。将20W数据与发病前驱期及发病期相应周龄数据对比,发现过表达组较未处理的发病前驱期稍有降低,与发病期相比显著降低。过表达的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞IL-17A的分泌在8、10、12W时高于对照组,16W以后一直保持在略低于对照组的水平。20W的过表达的NOD鼠较未处理的发病前驱期、发病期均显著降低。过表达的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞表达CD107A频率较发病前驱期、发病期均无明显变化。而胞浆内颗粒酶B(granzyme B)较发病前驱期、发病期均显著降低。穿孔素(Perforin)较发病前驱期、发病期亦显著降低。过表达的NOD鼠外周血中CD4+NKG2D+T细胞表达FASL频率较发病前驱期、发病期均无明显变化。而TGF-β较发病前驱期、发病期均显著升高。IL-10较发病前驱期、发病期亦显著升高。较CD4+NKG2D-T细胞,效应记忆性T细胞的频率较多,中枢记忆性T细胞与CD4+NKG2D-T细胞相比则略有提升。而初始T细胞频率则较CD4+NKG2DT细胞明显减少。过表达的NOD鼠外周血中的该群细胞较发病前驱期、发病期,CD69表达频率均升高,CD25表达频率较发病前驱期显著上升,与发病期几乎持平。与单独的CD8+T细胞相比,加入CD4+NKG2D+T细胞的培养体系中,其CD8+T细胞增殖加快。而CD4+NKG2DT细胞增殖则无明显变化。结论：过表达mInsB15-23H-2Kd的NOD鼠外周血中的CD4+NKG2D+T细胞不仅频率较空载体组及NOD鼠有所降低,该群细胞的活化程度也有一定幅度的增强,并且主要以效应记忆型细胞占多数。而功能上的最大改变就是,其RORyt的表达及IL-17的分泌显著降低。该群细胞可能是绕过对CD4+NKG2D-T细胞的调控,直接作用于CD8+T细胞。