木糖是自然界中储量第二的单糖,具有储量大、绿色环保和可再生的优点。但是相对葡萄糖来说,能够天然利用木糖的微生物较少,这大大制约了木糖通过微生物转化为高附加值产物的研究。本论文对大肠杆菌天然的木糖代谢途径进行改造,引入乳酸菌的木酮糖裂解途径,提高大肠杆菌对木糖的利用效率,利用该途径实现了聚-3-羟基丁酸酯(poly-3-hydroxybutyrate,PHB)的合成。论文首先利用Red重组的基因敲除方法,将大肠杆菌木糖代谢途径中编码核酮糖-5-磷酸异构酶的rpe基因进行敲除,阻断大肠杆菌中原有的木糖代谢途径,rpe突变体不能利用木糖生长。接下来,筛选得到两个来自乳酸菌的能够在大肠杆菌中具有正常功能的磷酸戊糖酮解酶基因ptk和xfp,迫使rpe基因缺失的大肠杆菌使用木酮糖裂解途径代谢木糖进行生长。敲除rpe并且分别表达ptk和xfp基因的重组菌能够在96h内完全消耗10g/L木糖,分别有2.43 g/L和3.12 g/L的乙酸生成。大量乙酸的积累阻碍了重组菌对木糖的高效利用,抑制大肠杆菌的生长。本论文接下来对大肠杆菌中乙酸生产相关的分支代谢途径进行了改造,敲除了编码丙酮酸氧化酶poxB和编码乙酸激酶ackA的基因。poxB和ackA基因缺失的突变体在发酵过程中仅有微量的乙酸积累,产量仅为0.07 g/L。最后,本论文在上述重组菌中表达了 PHB合成操纵子phaCAB,实现以木糖为碳源利用木酮糖裂解途径生产PHB。PHB合成是一个NADPH依赖的过程,重组菌在木糖代谢中生产的NADPH可能不足以支撑有效的PHB生产。论文尝试了表达NADP依赖的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因gapC、NAD激酶基因yfjB和转氢酶基因pnt等,调控细胞内辅酶的供给。表达gapC、yfjB和pnt基因的重组菌成功在胞内积累了 PHB,产量分别为0.84 g/L、0.09g/L和0.55 g/L,最高产量是对照菌株PHB产量的10倍。