在基于荧光标记的单分子DNA合成测序技术中,制备高密度单分子DNA芯片,即每一个样点只有一条DNA分子,是最关键的步骤之一。理想的单分子DNA芯片可将样点间距缩小到光学仪器的检测极限,以实现单位面积的数据量最大化,在通量与费用两方面解决现存单分子分步合成测序中的通量低和费用高的问题。但制备这种单分子DNA芯片的制备难度较大,限制了基于这种芯片的测序技术的发展和应用。以往报道的单分子DNA芯片制作方法有超稀溶液铺设和利用原子力显微镜(Atomic Force Microscope,AFM)针尖制作DNA纳米阵列等。超稀溶液铺设的DNA分子在基片表面呈现随机分布,样点间的间距不固定,分子分布不匀,无法实现单位面积的数据量最大化。而利用AFM制备的单分子DNA芯片密度高,样点间距小,但速度慢,同时,也无法保证每个点只含一个分子,不能满足制备高密度单分子芯片的要求。另一种方法是用DNA纳米球制作有图案的高密度单分子DNA芯片,虽然这种DNA分子在物理学上是单分子,但它需要通过滚环扩增产生,所以,在生物学意义上不是单分子。为此,我们提出了制作单分子DNA芯片的新方法,以期在基地上定点固定单分子DNA。本方法主要包括两部分,第一部分是基底制作,采用纳米加工技术,在基底上制备所需间距、经活化后可以绑定蛋白质的纳米点阵列,用于捕获携带1条DNA的单分子蛋白质。第二部分是大规模单分子蛋白质-DNA复合物的制备,我们利用链霉亲和素(Streptavidin,STV)蛋白和生物素标记的双链DNA(biotin-DNA)制备1STV-1DNA复合物。然后将1STV-1DNA复合物固定到纳米点阵列中。之所以采用STV蛋白作为单分子运载工具,是因为当前基于电子束曝光制备的纳米点的尺度与蛋白质可比,但还不能小到与DNA直径可比。可见,大批量获得高纯度1STV-1DNA复合物,是制作这种高密度单分子DNA芯片的先决条件之一。我们实验室之前制备1STV-1DNA复合物使用的是野生型STV,先将其与生物素修饰的双链DNA混合孵育,然后,将连接产物经凝胶电泳分离,最后切胶回收,得到1STV-1DNA复合物,过程复杂且效率不高。为此我们开发了一种新的方法来制备1STV-1DNA复合物,即使用单价STV。实验过程分为三部分内容。第一部分是制备单价STV,将生物素结合位点失活的STV变异体变性后的亚基与野生型STV变性后的亚基以摩尔比3:1的比例混合,然后重折叠复性,Ni-NTA柱层析分离得到四聚体中只有一个生物素结合位点的突变体STV,即单价STV。第二部分是制备biotin-DNA。第三部分是将单价STV与biotin-DNA以不同的摩尔比混合孵育。通过琼脂糖凝胶电泳和AFM观察复合物结果证明,该实验方法可行,并较之于使用野生型STV更为简便、高效。该方法不仅为单分子DNA芯片制备,也为单分子DNA操纵、单分子DNA-蛋白质相互作用研究等提供了便捷的方法。