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【研究目的】原发性高血压是人类的常见多发病,其并发的心力衰竭和脑卒中等心血管疾病严重威胁着人类的身心健康。除了血压升高外,交感神经活动亢进是高血压的另一个主要特征,并且与其发展及预后密切相关。调控交感神经活动的关键中枢位于头端延髓腹外侧区(rostral ventrolateral medulla,RVLM),已有研究表明RVLM神经元兴奋性增高是病理情况下交感神经活动亢进和血压升高的主要机制之一,而抑制RVLM神经元活动能有效降低血压及交感输出。SIRT1(silent information regulator-2 related enzyme 1)是一种烟碱胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的去乙酰化酶,与从酵母菌中发现的沉默信息调节因子2(silent information regulator-2,Sir2)高度同源。SIRT1能够使组蛋白和下游转录因子(如p53、NFκB、FOXOs和PPAR-γ等)修饰的赖氨酸残基去乙酰化,从而调控基因的转录表达,在代谢、衰老、肿瘤和昼夜节律等生理或病理活动中发挥重要作用。近年在外周心血管系统的研究中发现,SIRT1具有增强血管内皮功能、改善心肌缺血、减少动脉粥样硬化发生等心血管保护功能。在中枢神经系统也存在SIRT1的表达并具有生物学效应。然而,目前国内外尚未开展对中枢神经系统SIRT1在心血管功能调控中作用和意义的相关研究。氧化应激(oxidative stress)水平增强是高血压等心血管疾病病理过程的重要机制。氧化应激主要是由于活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的生成增加导致,氧分子接受电子后形成的超氧阴离子(O2-)是最主要的活性氧簇。研究证实RVLM内O2-的增加将导致交感神经输出增强和血压升高,而RVLM过表达过氧化物歧化酶(SOD)基因清除O2-具有显著改善高血压大鼠心血管功能的作用。在心脏和血管的多项研究中提示,SIRT1与氧化应激之间密切相关,但这种关系在高血压心血管功能中枢调控中的作用和意义尚不清楚。本课题的主要研究目的是探讨RVLM内SIRT1对高血压心血管活动的调控作用及机制,从而为中枢SIRT1在心血管疾病交感神经调控异常中的作用和意义提供理论依据,同时也为高血压的发病机制研究和防治策略提供新的思路。【研究方法】本实验采用18周龄,体重280-350 g的雄性正常血压大鼠Wistar-Kyoto(WKY)和自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats,SHR)为研究对象。首先,通过大鼠第四脑室微渗透泵灌流浓度为10 mM的SIRT1激动剂白藜芦醇(Resveratrol,第二军医大学硕士学位论文rsv)激活中枢sirt1,在整体(invivo)动物水平持续给药后监测动物的血压和心率变化,并监测交感神经活动情况,明确中枢sirt1对心血管活动的作用特点。溶剂对照组采用人工脑脊液(artificialcerebrospinalfluid,acsf)。实验动物分为4组:wky脑室灌流acsf组(wky+acsf),wky脑室灌流rsv组(wky+rsv),shr脑室灌流acsf组(shr+acsf)和shr脑室灌流rsv组(shr+rsv)。为进一步探究sirt1在心血管交感调控中枢rvlm内的作用及机制,采用大鼠大脑核团定点注射技术向rvlm内注射sirt1基因慢病毒(lenvi-sirt1),对照组采用gfp慢病毒(lenvi-gfp),并对处理前后动物的血压和心率进行持续监测。实验动物分为4组:wky转染lenvi-gfp组(wky-gfp),wky转染lenvi-sirt1组(wky-sirt1),shr转染lenvi-gfp组(shr-gfp),shr转染lenvi-sirt1组(shr-sirt1)。通过dhe荧光探针染色技术检测各组rvlm内氧化应激水平,westernblot技术检测rvlm内氧化应激相关蛋白nox4以及过氧化物歧化酶1(sod1)的表达变化。【结果】一、中枢去乙酰化酶sirt1对高血压大鼠心血管活动的调节作用1、sirt1在高血压大鼠rvlm的表达情况免疫荧光共定位发现大鼠rvlm前交感神经元上存在去乙酰化酶sirt1的表达。westernblot结果显示,shr组rvlm内sirt1蛋白表达量明显低于wky组(p<0.05,n=5)。2、中枢sirt1降低高血压大鼠的血压和交感神经活动水平第四脑室灌流1w,清醒及麻醉状态下血流动力学指标检测结果显示:与shr-acsf组相比,shr-rsv组的血压于处理后逐渐下降并稳定于低水平(shr-acsf组:162±1.8mmhg;shr-rsv组:145±1.7mmhg);shr-rsv组基础肾交感神经放电活动水平(26.6±1.0%)较shr-acsf组(38.1±1.7%)明显降低(p<0.05,n=5);wky两组间血压及交感神经活动水平无明显差异(p>0.05,n=5)。3、rvlm过表达sirt1基因降低高血压大鼠的血压rvlm慢病毒转染2w,清醒及麻醉状态下血流动力学指标检测结果显示:与shr-gfp组相比,shr-sirt1组的血压于处理后逐渐下降并稳定于低水平(shr-gfp组:168±1.3mmhg;shr-rsv组:143±2.7mmhg),差异有统计学意义(p<0.05,n=5);wky两组间的血压无明显差异(p>0.05,n=5)。二、中枢sirt1抑制高血压大鼠rvlm氧化应激dhe染色结果显示:shr组rvlm红色荧光强度明显高于wky组;与shr-gfp组相比,SHR-SIRT1组红色荧光强度降低(P<0.05,n=5),提示SHR的RVLM氧化应激与WKY相比明显增强,且SHR过表达SIRT1基因能降低RVLM氧化应激水平。三、中枢SIRT1下调RVLM内NOX4表达含量,并上调SOD1表达水平Western Blot结果显示:与WKY-GFP组相比,SHR-GFP组RVLM内NOX4蛋白表达含量明显增加,相反SOD1的表达含量则降低;与SHR-GFP组相比,SHR-SIRT1组RVLM内NOX4蛋白表达量下降约50%左右,而SOD1的表达量增加超过1倍(P<0.05,n=4);WKY两组间RVLM内NOX4及SOD1表达量无明显变化(P>0.05,n=4)。【结论】中枢去乙酰化酶SIRT1具有降低SHR血压和交感神经活动的作用,并与抑制RVLM氧化应激有关。