大肠腺瘤是一种临床较常见的具有癌变潜能的大肠良性病变，其组织学类型以管状腺瘤最为常见。研究表明，大肠腺瘤被认为是大肠癌主要的癌前病变，80%以上的大肠癌是发生在先存的腺瘤基础上。“正常大肠上皮-腺瘤-腺癌”的发病路径已被公认为是经典的大肠癌发病过程。但是大肠腺瘤癌变是一个多基因改变、多阶段综合作用累积的复杂过程，其确切机制仍不明确。因此对大肠腺瘤癌变机制的研究对于大肠癌的预防具有重要意义。Wnt/β-catenin是经典Wnt信号通路途径，在胚胎发育及多种肿瘤的发生、发展过程起着重要的作用。目前，已经公认Wnt/β-catenin信号通路是大肠腺瘤癌变过程中的关键信号通路之一，该通路的异常激活可以介导大肠腺瘤的癌变。分泌性Wnt蛋白是该途径的启动因子，其中Wnt2和Wnt5a主要在胃肠道肿瘤中表达。当细胞受到损伤因素的作用后，Wnt信号结合到卷曲蛋白胞外区，将胞质中Dsh蛋白募集至胞膜下，使Dsh活化从而抑制由Axin、APC和GSK-3β组成的复合物活性，导致β-catenin不能被GSK-3β磷酸化，进而导致β-catenin不能被降解,致使大量游离的β-catenin聚集在胞质中，随后进入胞核与转录因子TCF/LEF结合，激活其转录活性，启动一系列下游靶分子如c-myc、CDK4、CyclinD1、VEGF等，从而促进肿瘤发生。β-catenin是Wnt信号通路的核心分子,信号通路激活的关键在于β-catenin在细胞质中累积以及其与转录因子TCF/LEF的结合。Wnt、β-catenin、CDK4、CyclinD1是Wnt/β-catenin信号通路的重要组成成分,它们参与调节细胞增殖、抑制细胞分化及调控细胞周期，起着重要作用。高迁移率蛋白（HMGA2）是一种构架转录因子，普遍存在于真核生物中，其自身缺乏转录活性，但含有三个特殊的AT钩结构，这些AT钩结构可以结合到富集AT序列的染色质上，改变基因的DNA构象，或者直接与相关蛋白发生作用，继而增强或者抑制这些基因的转录活性，从而影响胚胎形成、组织发育，引起肿瘤的发生。HMGA2在分化成熟组织中很少表达或几乎不表达，而在胚胎期以及不成熟组织中大量表达。近年来大量研究发现，HMGA2在多种恶性肿瘤组织中出现异常表达，如肺癌、白血病、卵巢癌、大肠癌、甲状腺癌、胃癌、胰腺癌等，这些肿瘤的发生、发展均与HMGA2基因异常表达有关，被认为是一个潜在的肿瘤分子标志物。但目前有关HMGA2在在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中所起的确切作用及机制，尚缺乏系统性地研究。研究已经发现，HMGA2与TCFs家族中的TCF/LEF有一定的相似结构域，即含有HMG的DNA结合域,它能够增强β-catenin与TCF/LEF结合的转录活性，与Wnt/β-catenin信号通路关系密切。有研究表明HMGA2在转基因小鼠乳腺癌中可能受Wnt10b/β-catenin信号通路调控而影响肿瘤的增殖；在胃癌中HMGA2的异常表达可能会激活Wnt/β-catenin信号通路，从而促进EMT的进程。二者之间可能存在相互调控的作用。因此，鉴于Wnt/β-catenin信号通路在大肠腺瘤癌变中的重要作用以及HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路之间可能存在的相互调控作用，使得我们思考一个问题：HMGA2和Wnt/β-catenin信号通路是否共同参与调控散发性大肠管状腺瘤的癌变以及它们之间发挥怎样的调控作用，目前国内外尚未见相关报道。本实验第一部分首先选取大肠癌细胞株，采用siRNA技术、Realtime-PCR及Western blot方法，探讨HMGA2与经典Wnt/β-catenin信号通路在人大肠癌细胞中发挥怎样的调控作用；接着第二部分利用免疫组织化学方法，进一步在组织学上分析HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路相关基因（Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1）在大肠管状腺瘤癌变过程中的作用以及其与临床病理特征的关系，深入揭示散发性大肠管状腺瘤癌变的发生机制，为大肠管状腺瘤癌变的早期预防和临床靶向治疗提供科学依据。第一部分大肠癌细胞中HMGA2对Wnt/β-catenin信号通路调控作用的研究目的：在细胞水平上探讨HMGA2与经典Wnt/β-catenin信号通路之间发挥怎样的调控作用方法：1细胞培养选择三株人类结肠癌细胞株（HCT116、HT-29和SW480）进行体外培养。HCT116和HT-29细胞用含10%的胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素的RPMI-1640培养基培养；SW480细胞用含10%的胎牛血清配以105U/L青霉素、100mg/L链霉素的L-15培养基培养。细胞呈贴壁生长。2siRNA实验靶细胞的筛选HCT116、HT-29和SW480细胞分别于对数生长期时给予0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA消化，收集细胞。应用Real time-PCR及Western blot技术分别对三株人类结肠癌细胞中HMGA2的表达进行了检测，筛选高表达HMGA2的细胞株作为后续研究的靶细胞。3siRNA转染分别构建针对人HMGA2、Wnt2、β-catenin基因的siRNA序列,瞬时转染人结肠癌细胞株HCT116,同时转染Negtive control siRNA（NCsiRNA）作为阴性对照。分别检测HMGA2基因沉默后对Wnt/β-catenin信号通路的影响以及Wnt2或β-catenin基因沉默后对HMGA2的影响。4蛋白免疫印记（Western blot）转染处理HCT116细胞48h后，提取细胞总蛋白，用蛋白免疫印迹方法，检测转染处理后人结肠癌细胞株HCT116中HMGA2及Wnt/β-catenin信号通路相关分子的表达情况，采用Odyssey仪器进行显色分析，Bio-LD图像分析系统进行定量分析。5Real time-PCR转染处理HCT116细胞48h后，应用Real time-PCR检测HCT116细胞中HMGA2及Wnt/β-catenin信号通路相关分子的mRNA水平,采用Applied Biosystems公司提供的Comparative Ct (ΔΔCt)方法计算,计算目的基因的相对表达量。6统计学分析应用SPSS Statistics17.0软件，计量资料以均数±标准差(x s)表示，P<0.05时认为差异有统计学意义。结果：1筛选高表达HMGA2的人结肠癌细胞株对三株人结肠癌细胞中HMGA2mRNA及蛋白表达情况进行检测，结果发现HCT116、SW480和HT-29这三株细胞均表达HMGA2，但HCT116细胞HMGA2表达水平最高。因此，选择HCT116细胞作为本实验的研究对象。2siRNA干扰效率的检测2.1HMGA2siRNA干扰效率的检测于转染48小时后收集细胞，检测HMGA2siRNA的干扰效率。Real-time PCR结果显示，与NC siRNA对照组相比，HMGA2mRNA的表达在HCT116细胞HMGA2siRNA转染组中降低了78%。Western blot结果同样表明，HMGA2蛋白的表达在HMGA2siRNA转染组明显低于对照组细胞。以上结果表明所用HMGA2siRNA序列可以有效干扰HMGA2的表达。2.2Wnt2siRNA干扰效率的检测于转染48小时后收集细胞，检测Wnt2siRNA的干扰效率。Real-timePCR结果显示，与NC siRNA对照组相比，Wnt2mRNA的表达在HCT116细胞Wnt2siRNA转染组中降低了75%。Western blot结果同样表明，Wnt2蛋白的表达在Wnt2siRNA转染组明显低于对照组细胞。以上结果表明所用Wnt2siRNA序列可以有效干扰Wnt2的表达。2.3β-catenin siRNA干扰效率的检测于转染48小时后收集细胞，检测β-catenin siRNA的干扰效率。Real-time PCR结果显示，与NC siRNA对照组相比，β-catenin mRNA的表达在HCT116细胞β-catenin siRNA转染组中降低了79%。Western blot结果同样表明，β-catenin蛋白的表达在β-catenin siRNA转染组明显低于对照组细胞。以上结果表明所用β-catenin siRNA序列可以有效干扰β-catenin的表达。3HMGA2对体外培养HCT116细胞Wnt/β-catenin信号通路表达的影响3.1HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞Wnt2表达的影响于转染48小时后收集细胞，检测HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内Wnt2的影响。RT-PCR和Western blot结果显示，与NCsiRNA对照组相比，Wnt2mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2siRNA转染组没有明显变化(P＞0.05)；提示HMGA2不参与调控Wnt2的表达。3.2HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞β-catenin表达的影响于转染48小时后收集细胞，检测HMGA2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内β-catenin的影响。RT-PCR和Western blot结果显示，β-catenin mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2转染组低于阴性对照组(P<0.05)；提示HMGA2可以调控β-catenin的表达。4Wnt/β-catenin信号通路对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响4.1Wnt2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响于转染48小时后收集细胞，检测Wnt2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内HMGA2的影响。RT-PCR和Western blot结果显示，Wnt2siRNA转染组中HMGA2mRNA和蛋白的表达水平均较阴性对照组明显降低（P<0.05）；提示Wnt2可以调控HMGA2的表达。4.2β-catenin siRNA干扰对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响于转染48小时后收集细胞，检测β-catenin siRNA干扰对体外培养HCT116细胞HMGA2表达的影响。RT-PCR和Western blot结果显示，β-catenin siRNA转染组中HMGA2mRNA和蛋白的表达水平均较阴性对照组明显降低（P<0.05）；提示β-catenin可以调控HMGA2的表达。5HMGA2siRNA或Wnt/β-catenin siRNA干扰对信号通路相关因子的影响5.1HMGA2siRNA或Wnt2siRNA干扰对信号通路关键分子β-catenin的影响程度于转染48小时后收集细胞，检测HMGA2siRNA或Wnt2siRNA干扰对体外培养HCT116细胞内β-catenin的影响程度。RT-PCR和Westernblot结果显示，与NC siRNA对照组相比，β-catenin mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2或Wnt2转染组均有所降低（P<0.05），但在HMGA2转染组明显降低（P<0.05）；提示HMGA2或Wnt2均可以调控β-catenin的表达，但HMGA2起主要调控作用。5.2HMGA2siRNA、Wnt2siRNA或β-catenin siRNA干扰对信号通路下游分子CDK4及CyclinD1表达的影响程度于转染48小时后收集细胞，检测HMGA2siRNA、Wnt2siRNA或β-catenin siRNA干扰对对信号通路下游分子CDK4及CyclinD1的影响程度。RT-PCR和Western blot结果显示，与NC siRNA对照组相比，CDK4、CyclinD1mRNA和蛋白的表达水平在HMGA2、、Wnt2、或β-catenin转染组均有所降低（P<0.05），但在HMGA2转染组明显降低（P<0.05）；提示HMGA2、、Wnt2、或β-catenin均可以调控CDK4、CyclinD1的表达，但HMGA2起主要调控作用。第二部分HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的作用以及其与临床病理特征的关系目的：在组织学方面分析HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路相关基因（Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1）在大肠管状腺瘤癌变过程中的作用以及其与临床病理特征的关系。方法：1采用免疫组织化学SP三步法，研究37例正常大肠黏膜、121例散发性大肠管状腺瘤伴上皮异型增生病例、96例大肠管状腺瘤癌变病例中HMGA2、Wnt2、β-catenin、CDK4及CyclinD1蛋白的表达情况，探讨HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路的关系，并结合临床病理特征进行关联分析。2统计学分析：应用SPSS Statistics17.0软件，数据分析采用单因素方差分析、χ2检验、wilcoxon符号秩和检验及spearman相关性分析，P<0.05时其差异有统计学意义。结果：1HMGA2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况及其与临床病理特征关系1.1HMGA2蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示，HMGA2蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高，分别是0.00%（0/37）、37.19%（45/121）、77.08%（74/96），其中管状腺瘤伴不同程度异型增生组和管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组（P<0.05），而且管状腺瘤癌变组明显高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组（P<0.05）。HMGA2的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组分别为17.39%（8/46）、38.64%（17/44）、70.97%（22/31），其中中、重度异型增生组高于轻度异型增生组（P<0.05），重度异型增生组高于中度异型增生组（P<0.05）。1.2HMGA2蛋白的表达与临床病理特征的关系1.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中HMGA2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中HMGA2蛋白的阳性表达率与腺瘤分级密切相关（χ2=22.379，P<0.05）；而与患者年龄、性别、腺瘤大小、腺瘤发生部位无关（P>0.05）。1.2.2管状腺瘤癌变组中HMGA2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中HMGA2蛋白阳性表达率与淋巴结转移及TNM分期密切相关（χ2=13.225及χ2=4.657；均P<0.05）；而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位以及浸润深度无关（P>0.05）。2Wnt2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况以及其与临床病理特征关系2.1Wnt2蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示，Wnt2蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高，分别是5.40%（2/37）、43.80%（53/121）、90.63%（87/96），其中管状腺瘤伴不同程度异型增生和管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组（P<0.05），而且管状腺瘤癌变组高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组（P<0.05）。Wnt2的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中逐渐升高，分别为32.61%（15/46）、38.64%（17/44）、67.74%（21/31），但各组之间无明显差别（P>0.05）。2.2Wnt2蛋白的表达与临床病理特征关系2.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中Wnt2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中Wnt2蛋白的阳性表达率与患者年龄、性别、腺瘤大小、腺瘤发生部位及腺瘤分级均无关（P>0.05）。2.2.2管状腺瘤癌变组中Wnt2蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中Wnt2蛋白阳性表达率与浸润深度、Dukes分期密切相关（χ2=10.965及χ2=13.574；均P<0.05）；而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位及淋巴结转移无关（P>0.05）。3β-catenin在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况与临床病理特征关系3.1β-catenin蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示，β-catenin蛋白的阳性表达位于细胞膜、细胞浆及细胞核，37例正常大肠黏膜组阳性表达全部位于细胞膜上，为正常表达。β-catenin蛋白随着腺瘤异型增生以及癌变的出现其细胞浆和细胞核异常表达率逐渐升高，其中正常大肠黏膜组、管状腺瘤异型增生组以及管状腺瘤癌变组中的异常表达率分别是0.00%（0/37）、50.41%（61/121）、90.63%（87/96）；管状腺瘤异型增生组和管状腺瘤癌变组中β-catenin的异常表达率明显高于正常大肠黏膜组（P<0.05），而且管状腺瘤癌变组中β-catenin的异常表达率明显高于管状腺瘤异型增生组（P<0.05）。大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中β-catenin的异常表达率分别为21.74%（10/46）、52.27%（23/44）、90.32%（28/31），其中中、重度异型增生组中β-catenin的异常表达率明显高于轻度异型增生组及正常大肠黏膜组（P<0.05），重度异型增生组β-catenin蛋白异常表达率明显高于中度异型增生组（P＜0.05）。β-catenin的异常表达率随着腺瘤异型增生程度的升高其阳性率逐渐升高（P<0.05）。3.2β-catenin蛋白的表达与临床病理特征关系3.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中β-catenin蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中β-catenin蛋白的异常表达率与腺瘤分级密切相关（χ2=34.942，P<0.05）；而与患者年龄、性别、腺瘤大小及腺瘤发生部位均无关（P>0.05）。3.2.2管状腺瘤癌变组中β-catenin蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中β-catenin蛋白的异常表达率淋巴结转移和浸润深度密切相关（χ2=11.190及χ2=6.374；均P<0.05）；而与患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤发生部位及Dukes分期无关（P>0.05）。4CDK4在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况以及其与临床病理特征关系4.1CDK4蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示，CDK4蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高，分别是8.10%（3/37）、41.32%（50/121）、88.54%（85/96），其中管状腺瘤伴不同程度异型增生和管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组（P<0.05），而且管状腺瘤癌变组高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组（P<0.05）。CDK4的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中逐渐升高，分别为15.22%（7/46）、36.36%（16/44）、87.10%（27/31），其中中、重度异型增生组明显高于轻度异型增生组（P<0.05），重度异型增生组高于中度异型增生组（P<0.05）。4.2CDK4蛋白的表达与临床病理特征关系4.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CDK4蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CDK4蛋白的异常表达率与腺瘤分级密切相关（χ2=43.791，P<0.05）；而与患者年龄、性别、腺瘤大小及腺瘤发生部位均无关（P>0.05）。4.2.2管状腺瘤癌变组中CDK4蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中CDK4蛋白阳性表达率与淋巴结转移、Dukes分期及浸润深度密切相关（χ2=15.638、χ2=6.269及χ2=5.998；均P<0.05）；而与患者年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤发生部位无关（P>0.05）。5CyclinD1在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中的表达情况以及其与临床病理特征关系5.1CyclinD1蛋白的表达情况免疫组织化学结果显示，CyclinD1蛋白的阳性表达率在正常大肠黏膜组、管状腺瘤伴不同程度异型增生组以及管状腺瘤癌变组中逐渐升高，分别是18.92%（7/37）、53.72%（65/121）、92.71%（89/96），其中管状腺瘤伴不同程度异型增生组及管状腺瘤癌变组明显高于正常大肠黏膜组，而且管状腺瘤癌变组高于管状腺瘤伴不同程度异型增生组（P<0.05）。CyclinD1的阳性表达率在大肠管状腺瘤伴上皮轻、中、重度异型增生组中逐渐升高,分别为21.74%（10/46）、59.09%（26/44）、93.54%（29/31），其中中、重度异型增生组明显高于轻度异型增生组（P<0.05），重度异型增生组高于中度异型增生组（P<0.05）。5.2CyclinD1蛋白的表达与临床病理特征关系5.2.1管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CyclinD1蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤伴不同程度异型增生组中CyclinD1蛋白的异常表达率与腺瘤分级密切相关(χ2=39.214，P<0.05)；而与患者年龄、性别、腺瘤大小及腺瘤发生部位均无关(P>0.05)。5.2.2管状腺瘤癌变组中CyclinD1蛋白的表达与临床病理特征的关系管状腺瘤癌变组中CyclinD1蛋白阳性表达率与淋巴结转移、Dukes分期及浸润深度密切相关（χ2=15.638、χ2=6.269及χ2=5.998；均P <0.05）；而与患者年龄、性别、肿瘤大小及肿瘤发生部位均无关（P>0.05）。6在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中，HMGA2与Wnt2/β-catenin信号转导通路相关蛋白（Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1）关联性分析相关分析结果显示，在散发性大肠管状腺瘤伴异型增生组及腺瘤癌变组中HMGA2与Wnt2、β-catenin、CDK4、CyclinD1均呈正性相关（r=0.285,r=0.414,r=0.229,r=0.215,均P<0.05）。结论：第一部分：1沉默Wnt2或β-catenin均可抑制HMGA2的表达，而沉默β-catenin更能有效的抑制HMGA2的表达，提示Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin可能对HMGA2起主要调控作用。2HMGA2可以参与调控β-catenin及其下游分子，提示HMGA2与β-catenin之间存在相互调控。第二部分：1HMGA2可能参与了散发性大肠管状腺瘤癌变的发生，并且其表达水平与淋巴结转移及TNM分期密切相关。2在散发性大肠管状腺瘤癌变过程中，HMGA2与Wnt/β-catenin信号通路可能发挥协同作用。