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抗冻蛋白(Antifreeze protein, AFP)是寒区动物、植物和真菌为了在严寒的环境下生存而产生的一类多肽。矮沙冬青(Ammopiptanthus nanus)是中亚沙漠地区独有的四季常绿阔叶灌木,它是在第三纪古地中海消失后幸存在塔里木盆地西部边缘的古老物种,其分布区域常年都是干旱气候且具有-30℃到40℃的极端温度。在本研究中,我们通过PCR扩增出矮沙冬青抗冻蛋白基因(AnAFP),生物信息学分析其可能存在的功能,构建AnAFP基因的原核表达载体和植物表达载体,转化大肠杆菌(Escherichia coli)和烟草(Nicotiana benthamiana)。根据转化菌株与野生型对照在低温条件下的存活率,和转基因烟草与野生型烟草在低温条件下的耐寒性差异,验证AnAFP基因的功能。研究结果如下：1.生物信息学分析表明,AnAFP与豆科植物的多种抗逆相关蛋白同源。其中,AnAFP与蒙古沙冬青(Ammopiptanthus mongolicus)冷诱导蛋白(cold-induced protein, GenBank no.AAT01285.1)同源性最高(68%); AnAFP蛋白具有高甘氨酸含量(23.2%),与冬季欧白英(Solanum dulcamara)抗冻蛋白类似(甘氨酸含量23.7%)；AnAFP是一个具有亲水性且稳定的蛋白；它没有信号肽,既不是跨膜蛋白,也不是分泌蛋白,可能在细胞质中起作用；二级结构中不规则卷曲(random coils)所占比例高达72.91%,这是II型AFP的特征。这些分析都表明此蛋白具有抗冻蛋白应有的特性。2.将AnAFP基因插入pET-32a质粒,构建原核表达载pET-32a-AnAFP,用以转化大肠杆菌Rosetta菌株。异丙基-p-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl β-D-thiogalactoside, ITPG)诱导表达,十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总蛋白。结果表明,转pET-32a-AnAFP载体的菌株明显多出一条大约42 kDa的蛋白带,而其他三个对照组没有,表明AnAFP基因在大肠杆菌中异源过表达。3.0℃低温胁迫处理转化菌株及其对照,通过稀释涂板计数后,分别统计其存活率。经IPTG诱导的转化菌株存活率明显高于未经诱导的转化菌株,空载体转化菌株,以及未转化的野生型菌株,表明其抗寒能力明显增强。4.构建植物表达载体pRI201-GUS-AnAFP,农杆菌介导转化烟草品种"Wisconsin38",通过卡那筛选得到了100多株T0代再生植株,大约1/3特异经PCR扩增检测为阳性,其中3株GUS染色呈现蓝色。对这3株自交T1代株系的再次特异PCR检测和Southern杂交表明,这3株是相互独立的转化事件。5.实时荧光定量PCR检测T2代烟草株系AnAFP基因在低温(-3℃)胁迫条件下的差异表达。结果表明,AnAFP基因的相对表达量在低温胁迫初期略有下降,随后逐渐升高,在4-12 h时达到最大值。不同的株系间略有差异,但变化趋势大致相同。由此说明,AnAFP基因在转基因烟草中异源表达,且响应低温胁迫。6.在低温(-3℃)胁迫的不同时间段取样,测定烟草叶片相对电导率的变化。在低温胁迫下,T2代转基因株系和未转基因野生型对照的相对电导率都明显增强,但是转基因株系相对电导率的增长幅度明显低于野生型对照。由此说明,转基因株系烟草细胞质膜的渗透性在低温胁迫条件下更为稳定,可能利于耐寒性的增强。7.将T2代转基因株系及未转基因野生型对照置低温(-3℃)胁迫处理16 h,然后转室温环境解冻。未转基因野生对照整株迅速萎蔫,而大部分转基因株系只有下部叶片萎蔫,整株仍保持挺立。综上所述,矮沙冬青抗冻蛋白基因AnAFP具有较强的抗冻功能,在大肠杆菌和烟草中异源表达可提高其耐寒性,进一步验证其功能和安全性后可用于作物的耐寒转基因研究。