背景：随着社会经济的快速发展，大量的化学物涌入人类的生产﹑生活和周围环境，由此产生危害人体健康的安全问题日益突出。对这些化学物进行合理的毒性测试（Toxicity Tsting），是风险评估和风险管理的基础。毒性测试即可以以整体动物为载体，也可以应用体外的细胞器﹑细胞﹑组织和器官等载体开展。随着细胞分子生物学理论和方法在毒理学研究中的应用，对外源化学物质的毒性测试已经发展到体内试验与体外分子细胞水平相结合的毒性测试的新模式。2007年美国国家研究委员会（NCR）发布的《21世纪毒性测试：远景与策略》报告，进一步促进了毒性测试由传统的基于整体动物的体内测试转向基于人源细胞﹑细胞器，整合机制研究的体外测试。虽然短期内，以整体动物为载体的传统毒性测试将与以应用体外的细胞器﹑细胞﹑组织和器官的毒性测试替代方法并存，但从长远来看，毒理学替代方法是毒性测试新的发展方向和趋势。这不仅是动物福利的需要，也是获取高通量﹑可靠毒性测试数据的需求。故本论文基于毒性测试的替代方法，分两部分展开。第一部分应用可减少动物使用数量的清醒遥测动物技术，研究清醒遥测小型猪在化学物质心血管系统毒性测试中替代清醒遥测犬的可行性；第二部分以人源心肌细胞系为研究模型，研究已知的具有明显心脏毒性的化合物阿霉素（Doxorubicin）对线粒体新生和PGC-1ɑ信号通路的影响，旨在找到化学物线粒体毒性的可能毒性通路并阐明化学物诱导线粒体毒性发生的作用机制，构建化学物致线粒体毒性评价的关键通路框架，为后续预测化学物导致线粒体毒性通路扰动的阈剂量，以及结合PBPK模型预测化学物质在人体内的分布特征，综合评价化学物质对线粒体的毒性与安全性提供依据。目的：第一部分：清醒小型猪心血管遥测模型替代清醒比格犬模型在心血管安全药理学评价中的应用建立可在清醒状态下长期动态监测小型猪和比格犬血压﹑心率﹑心电图和体温的遥测模型，阐明小型猪模型替代比格犬模型在心血管安全药理学评价中应用的可行性，同时优化心血管遥测实验步骤，达到减少动物使用量提高实验数据质量的目的。第二部分：DOX致心肌细胞线粒体损伤的作用机制研究及线粒体毒性评价的关键通路的识别研究对线粒体新生和抗氧化相关的PGC-1ɑ信号通路在DOX引起的心肌细胞线粒体损伤中的关键调控作用。旨在找到化学物线粒体毒性的可能毒性通路并阐明化学物诱导线粒体毒性发生的作用机制，构建化学物致线粒体毒评价的关键通路框架，为后续建立毒性通路剂量-反应模型预测化学物导致线粒体毒性通路扰动的阈剂量提供依据，为进一步结合PBPK模型预测化合物在人体内的分布特征，综合评价化学物对线粒体的毒性与安全性做准备。方法：第一部分清醒小型猪心血管遥测模型替代清醒比格犬模型在药物心血管安全药理学评价中的应用1.清醒小型猪和清醒比格犬遥测模型的建立：在无菌手术室内通过手术分别将可动态监测心电图，血压，心率和体温的遥测传感器（DSI，TL11M3-D70-PCT和TL11M3-D70-PCTP）植入8只比格犬（8.1-10.6kg）和8头小型猪（15.6-18.5kg）体内，恢复三周后根据动物一般状况﹑体温﹑心电图﹑血压和心率等信号是否正常来判定动物模型是否建立成功。2.模拟给药﹑喂食对清醒小型猪和比格犬心血管系统的影响：将遥测比格犬和小型猪随机分成两组，喂食组和非喂食组，每组每种动物各四只。喂食组的实验中，连续监测4条比格犬和4头小型猪的体温﹑心电图﹑血压和心率信号2h作为基线数据后，分别给予4ml/kg的无菌水模拟灌胃，用来比较给药动作对两种动物心血管参数的影响；继续监测两种动物心血管参数6h后，进行喂食，然后继续监测18小时，比较喂食对两种动物心血管参数的影响的差异；整个监测过程包含12h/12h昼/夜循环，以比较两种动物心血管参数昼夜节律性的差异。非喂食组也包含4条比格犬和4头小型猪，在监测心血管各项参数过程中所有动物不进食，其余步骤同喂食组，以比较喂食与否对两种动物心血管参数昼夜节律性的影响。第二部分DOX致心肌细胞线粒体损伤的作用机制研究及线粒体毒性评价的关键通路的识别1.DOX对AC16细胞线粒体新生的影响DOX致细胞毒性和线粒体毒性量效关系检测：DOX染毒分为对照组﹑31.25﹑62.5﹑125﹑250﹑500﹑800﹑1000和2000nM组，染毒时间为12h，染毒后分别用MTT法检测细胞存活率﹑激光共聚焦显微镜检测线粒体膜电位和线粒体超氧阴离子水平，荧光定量PCR检测线粒体DNA拷贝数﹑western blot检测抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2的表达﹑线粒体新生相关蛋白PGC-1α﹑NRF-1﹑COXⅠ和SDH-A的表达，同时检测细胞LDH漏出率﹑ATP水平。DOX致细胞毒性和线粒体毒性时效关系检测：DOX染毒分为125和1000nM组，检测时间点设为0﹑1﹑3﹑6﹑12和24h，检测指标分别为：细胞存活率﹑LDH漏出﹑ATP水平以及抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2的表达﹑线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1的表达。2.DOX可能通过PGC-1α线粒体新生信号通路产生心肌细胞毒性应用转染技术将PCG-1α siRNA转入AC16细胞，建立PCG-1α敲降细胞模型。细胞存活率检测和LDH漏出检测：分别采用正常AC16细胞模型和PCG-1α敲降AC16细胞模型，DOX染毒分为对照组﹑31.25﹑62.5﹑125﹑250﹑500﹑800﹑1000和2000nM组，染毒时间为12h。其他检测指标同第1小节，采用的细胞模型为正常AC16细胞模型和PCG-1α敲降AC16细胞模型，染毒组为对照组，DOX125nM和1000nM组。3.PGC-1α与低剂量DOX诱导的O2之间可能存在负反馈机制并影响细胞毒性应用MitoTEMPO预处理细胞30min，随后与DOX共同孵育12h，以未经MitoTEMPO预处理细胞和共孵育的细胞为对照，分别设DOX0﹑125﹑和1000nM剂量组，检测指标同第1小节。结果：第一部分清醒小型猪心血管遥测模型替代清醒比格犬模型在药物心血管安全药理学评价中的应用1．清醒小型猪和清醒比格犬遥测模型的建立小型猪和比格犬实施植入手术后均恢复良好，在恢复期动物体温无升高，无感染，无合并症，一般状态良好。21d恢复期过后，两种动物均可在清醒自由活动状态下监测到心血管系统参数和体温等参数，提示清醒小型猪和清醒比格犬遥测模型的建立。2．模拟给药﹑喂食对清醒小型猪和比格犬心血管系统的影响心电图质量：在整个监测周期中，遥测小型猪的心电图质量明显优于遥测比格犬心电图的质量（P＜0.05）。模拟给药和喂食后，遥测小型猪心电图质量恢复到基线水平的时间明显短于遥测犬恢复到基线水平所需的时间。心率：模拟给药后，遥测小型猪和比格犬的心率都明显加快，但小型猪心率恢复到基线的时间明显短于遥测犬（P＜0.05）。喂食后，比格犬心率在45min内恢复到基线水平，而小型猪心率维持在较高的水平，在4h左右恢复到正常水平。在12h/12h昼夜循环周期内，在喂食组中，并未观察到比格犬的心率具有明显的昼夜节律性（P＞0.05），而小型猪的心率具有明显的昼夜节律性（P＜0.05）。非喂食组的心率数据证实该昼夜节律性是由于喂食引起的。血压：模拟给药和喂食都可引起遥测小型猪和比格犬平均动脉血压升高，模拟给药和喂食后，小型猪的血压恢复到基线水平所需要的时间都明显短于比格犬（P＜0.05）。在两种动物中，未观察到血压具有明显地昼夜节律性。活动度：模拟给药和喂食都可引起遥测小型猪和比格活动度明显升高（P＜0.05），模拟给药和喂食后，小型猪的活动度恢复到基线水平所需要的时间都明显短于比格犬（P＜0.05）。无论喂食与否，两种动物的活动都具有明显的昼夜节律性（P＜0.05）。体温：在喂食组和非喂食组，都观察到遥测小型猪的体温具有明显地昼夜节律性（P＜0.05），而遥测比格犬的体温并没有明显地昼夜节律性。第二部分DOX致心肌细胞线粒体损伤的作用机制研究及线粒体毒性评价的关键通路的识别1. DOX对AC16细胞线粒体新生的影响量效关系：AC16细胞暴露于DOX24h后，IC50为4.9μM；DOX以9个剂量的浓度梯度作用于AC16细胞12h后，从125nM DOX染毒剂量开始，细胞存活率﹑线粒体膜电位﹑ATP水平均呈剂量依赖性降低（与对照相比P＜0.05）；而LDH漏出和细胞线粒体内超氧阴离子水平呈剂量依赖性增加（与对照相比P＜0.05）；而线粒体新生相关蛋白﹑线粒体新生和抗氧化蛋白在DOX染毒剂量小于等于125nM时，均出现诱导（与对照相比P＜0.05），当剂量大于250nM时，随着剂量的增加，呈现剂量依赖性的下降（与对照相比P＜0.05）。时效关系：在125nM DOX暴露后的各个时间点均未观察到细胞存活率﹑LDH漏出﹑ATP水平﹑线粒体膜电位和线粒体超氧阴离子水平有明显变化，而抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1在DOX暴露3h后的表达均呈剂量依赖性增加，约在24h达到峰值。在125nM DOX暴露1h后未观察到细胞存活率﹑LDH漏出﹑ATP水平﹑有明显变化，此时抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1表达增加；从暴露第3h开始细胞存活率﹑LDH漏出和ATP水平呈现时间依赖性下降，在第24h达到低谷水平，而此时抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1表达也呈时间依赖性下降。2. DOX可能通过PGC-1α线粒体线粒体新生信号通路产生心肌细胞毒性与正常细胞相比，转入PGC-1αsiRNA20pM的细胞PGC-1α蛋白表达明显降低，约为对照的50%左右，且随PGC-1αsiRNA转染剂量加大，PGC-1α蛋白表达呈现剂量依赖性的降低。PGC-1α敲降细胞在暴露于125nM DOX12h后即出现细胞存活率降低﹑LDH漏出增加，随着作用剂量的增加，细胞存活率呈现剂量依赖性下降，LDH漏出呈现剂量依赖性增加，且在相同DOX作用剂量下，PGC-1α敲降细胞的损伤更为严重。DOX125nM染毒后，PGC-1α敲降细胞线粒体膜电位﹑ATP生成﹑抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1﹑线粒体新生均受到抑制，细胞线粒体超氧阴离子水平升高，而正常细胞在该剂量下抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1诱导表达，线粒体膜电位﹑ATP生成和线粒体超氧阴离子水平无明显变化。DOX1000nM染毒12h后，正常AC16细胞和PGC-1α敲降细胞线粒体膜电位﹑ATP生成﹑抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2以及线粒体新生相关蛋白PGC-1α和NRF-1﹑线粒体新生均受到抑制，但PGC-1α敲降细胞抑制更为严重，在该剂量下PGC-1α敲降细胞线粒体超氧阴离子水平要明显高于正常细胞。3. PGC-1α与低剂量DOX诱导的O2之间可能存在负反馈机制并影响细胞毒性与未经MitoTEMPO处理的细胞相比，经MitoTEMPO处理的细胞暴露于125nM DOX12h后，线粒体新生相关蛋白﹑抗氧化蛋白和线粒体新生均未诱导，与对照维持在相同水平，也未观察到细胞存活率﹑LDH漏出﹑线粒体膜电位和超氧阴离子﹑ATP水平有明显变化。暴露于1000nM DOX12h后，经MitoTEMPO处理的细胞和未经MitoTEMPO处理的细胞线粒体新生相关蛋白表达﹑抗氧化蛋白表达和线粒体新生﹑细胞存活率﹑线粒体膜电位和ATP水平均显著降低，但未经MitoTEMPO处理的细胞降低程度更甚，在该剂量下，LDH漏出和线粒体超氧阴离子均增加，而未经MitoTEMPO处理的细胞增加的幅度更大。结论：第一部分清醒小型猪心血管遥测模型替代清醒比格犬模型在药物心血管安全药理学评价中的应用清醒小型猪的心电图质量，血压，活动度等指标在模拟给药和喂食后恢复到基线水平所需的时间明显短于清醒比格犬模型，提示清醒遥测小型猪可以替代比格犬用于化合物的心血管安全性评价。但鉴于喂食对小型猪心率的持久影响，在实验开展前至少应提前4h禁食或者尽量避开受试物的Tmax喂食动物。另外，当受试化合物可能对体温有影响时，应尽量避免使用清醒小型猪作为评价模型。第二部分DOX致心肌细胞线粒体损伤的作用机制研究及线粒体毒性评价的关键通路的识别1. DOX对AC16细胞的细胞毒性和线粒体毒性呈现明显的剂量依赖性；DOX对线粒体新生有双向影响，可能与PGC-1α信号通路密切相关。2. PGC-1α线粒体新生信号通路是参与调控DOX致心肌细胞毒性的关键通路，DOX对PGC-1α具有双向的调节作用，即相对低剂量的DOX诱导PGC-1α的表达，一方面与NRF-1共激活，通过TFAM促进线粒体新生，另一方面PGC-1α的诱导可激活抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2，使线粒体内的超氧阴离子平衡，细胞和线粒体功能得以维持；而在高剂量DOX暴露后可抑制PGC-1α的表达，一方面线粒体新生受到抑制，另一方面PGC-1α的低表表可抑制抗氧化蛋白MnSOD和UCP-2，使线粒体内的超氧阴离子续集，形成恶性循环，细胞和线粒体功能受损。3. PGC-1α信号通路在DOX致心肌细胞毒性的发生和发展过程中起着关键的作用，是决定细胞适应性反应和毒性发生的关键调节因子，这为开发预防和治疗DOX临床心脏毒性的药物提供了潜在的指导；PGC-1α信号通路在DOX致心肌细胞毒性中发挥了关键的作用，该通路可能是心脏毒性的潜在“毒性通路”。