研究背景:类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)是一种以慢性侵袭性滑膜炎症和骨质破坏为临床特征的自身免疫性疾病。患病人数占世界人口的0.5%～1.0%,在我国的患病率约为0.32%～0.36%。在RA的自然病程中,其致残率高达15%,成为威胁人类健康的杀手。因此早期诊断和治疗至关重要。RA的病因迄今未明,可能与遗传、感染、环境、免疫等多种复杂因素的交互作用相关。自身免疫反应介导的免疫损伤贯穿RA整个病程。既往研究证明,高表达的自身抗体(包括类风湿因子、抗环瓜氨酸肽抗体等)和滑膜组织中大量T淋巴细胞的浸润,证实RA患者体内存在体液和细胞免疫的激活。RA患者体内naiveT细胞数量非常少,大多数T细胞处于活化状态,表达CD69、CD28、CTLA-4、CD40等多种共刺激分子,参与辅助刺激淋巴细胞活化,上调黏附分子、产生细胞因子和趋化因子,促进炎症反应病理过程。如果缺乏这些共刺激分子,会导致抗原识别的免疫耐受和淋巴细胞活化障碍。寻找新的淋巴细胞活化标记,不仅为深入了解RA发病机制提供帮助,也可对RA的病情判断和治疗提供新的靶标。跨膜糖蛋白CD38分子广泛表达于淋巴细胞,既是细胞表面受体又具有酶活性,可以催化环二磷酸腺苷核糖(cyclic adenosine diphosphate ribose,cADP)和烟酸腺嘌呤二核苷酸磷酸(nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,NAADP)两种钙信使物质的代谢,参与胞内信号传导,调节淋巴细胞增殖与凋亡、分化成熟和迁移,是淋巴细胞活化的表面标记。近年来研究发现,CD38分子功能的丧失与固有和适应性免疫应答改变和损伤密切相关,参与了多种自身免疫性疾病的发病过程。CD38基因敲除的胶原诱导关节炎小鼠模型呈现淋巴细胞迁移障碍,炎症细胞在滑膜组织浸润减少,关节炎症反应减轻。我们课题组前期应用转录组学技术发现在RA患者滑膜组织中CD38分子mRNA表达显著高于骨关节患者,提示CD38可能在RA中发挥作用。CD56是神经细胞黏附分子和NK细胞的标志物,我们免疫组化实验结果证实CD38和CD56在RA滑膜组织中共表达,这说明CD38分子可能通过调节固有免疫参与RA发病机制。为进一步阐明CD38分子是否通过调节免疫反应参与RA发病,本课题通过临床和体外细胞实验研究CD38分子在RA患者外周血淋巴细胞亚群的分布和其调节机制,为以CD38分子作为靶点的小分子化合物治疗提供理论依据。第一部分目的:研究CD38在RA患者体内不同淋巴细胞亚群中的表达差异及RA外周血淋巴细胞CD38表达水平的影响因素;RA患者不同淋巴细胞亚群分布格局和激活状态,着重研究RA外周血NK细胞数量和表型变化。方法:随机选取RA患者139例为病例组,年龄、性别匹配的正常健康人群120例为健康对照组。详细采集患者人口学特征(性别、年龄)、病程、关节肿胀数(SJC)、关节压痛数(TJC)、VAS评分、类风湿因子(RF)、抗环瓜氨酸肽抗体(anti-CCP)、血沉(ESR)、C反应蛋白(CRP)、计算疾病活动指数(DAS28-CRP),关节骨侵蚀分级。采用多色流式细胞术检测NK(CD3-CD56+)细胞、T(CD3+)、B(CD19+)淋巴细胞比例和 CD38 阳性 NK、T、B(CD19+)淋巴细胞比例。一般线性模型分析影响RA外周血NK细胞比例的相关因素。Pearson和Spearman等级相关分析CD38阳性总淋巴细胞比例与临床指标间的相关关系。线性相关分析CD38阳性总淋巴细胞比例与疾病活动性指标CRP、DAS28-CRP的相关系数。结果:1.RA患者外周血T淋巴细胞(CD3+)和辅助/诱导T淋巴细胞(Th细胞CD3+CD4+)比例高于健康对照组,两组间存在统计学差异(P=0.0065;P=0.0038)。抑制/细胞毒T细胞(Ts细胞CD3+CD8+)和B淋巴细胞(CD19+)比例两组间无统计学差异(P=0.613;P=0.587)。RA患者NK细胞(CD3-CD56+)占淋巴细胞的比例低于健康对照组,两组间有统计学差异(P=0.033)。中高度活动组RA患者NK细胞在外周血的下降尤为显著。患者外周血CD38+总淋巴细胞比例显著高于健康对照组(P=1.91E-09)。CD38分子在Th淋巴细胞和NK细胞表达均显著高于健康对照组(P值均小于0.05),而CD38+B淋巴细胞和CD38+Ts细胞比例在RA和健康人群两组间无统计学差异(P值均大于0.05)。2.一般线性模型分析显示,RA患者外周血NK细胞比例不受年龄、病程、关节骨侵蚀分级的影响,主要受疾病活动度的影响。3.Pearson和Spearman等级相关分析提示,RA患者外周血CD38在淋巴细胞表达频数与CRP、疾病活动度(DAS28-CRP)呈现正相关关系,而与类风湿血清标志物(RF、anti-CCP)是否阳性,年龄、病程、骨侵蚀分级无相关关系。线性回归分析CD38总淋巴细胞表达频数与CRP、DAS28-CRP相关系数分别为R2=0.255 和 R2=0.288。结论:1.RA患者外周血中Th细胞、NK细胞均高表达活化标记CD38分子,说明以上两种细胞处于激活状态,2.RA患者外周血NK细胞比例较健康人群减少,其比例受到疾病活动度影响。3.CD38在淋巴细胞表达频数与CRP、DAS28-CRP呈线性正相关关系。第二部分目的:研究NK细胞及其CD38阳性亚群在RA患者外周血、滑液、滑膜组织中的分布特征。方法:选取合并单或双侧膝关节积液的RA患者36例,以及性别、年龄与RA患者匹配的29例来自体检中心的正常健康人作健康对照组。流式细胞仪检测健康人外周血和患者配对的外周血、膝关节滑液中NK、CD38亚群、及NK细胞表面趋化因子受体(CXCR3、CCR5)、颗粒酶B、穿孔素的表达。采用酶消化法分别制备10例RA新鲜滑膜组织单细胞悬液,密度梯度离心法获得淋巴细胞,流式细胞术测定滑膜组织中NK、CD38亚群细胞比例。35例行关节镜或关节置换术RA患者和25例行关节置换术OA患者的术后石蜡包埋的滑膜组织,做CD38和CD56分子免疫组化。结果:1.RA患者滑液中NK细胞占淋巴细胞的比例显著高于患者外周血,两者间有统计学差异(P<0.05)。RA患者外周血中NK细胞高表达趋化因子受体CCR5和CXCR3,与正常健康人群存在统计学差异(P<0.05),两种趋化因子受体主要表达于CD38+NK细胞亚群。2.RA患者滑液NK细胞表达颗粒酶B和穿孔素水平高于自身外周血和正常健康人群外周血(P值均小于0.05)。3.RA患者外周血和滑液NK细胞上CD38分子表达水平均高于正常健康人群外周血(P值均小于0.05)。4.免疫组化显示,滑膜衬里层、衬里下层浸润的炎性细胞以及成纤维细胞均可见CD38的棕黄色阳性表达,染色强度为中等,成块状或均质样分布;CD56染色阳性细胞主要表达于血管内及其周围组织。结论:1.RA患者炎症部位(滑液、滑膜)均存在NK细胞异常浸润。2.RA患者外周血NK细胞高表达CC族趋化因子,并集中表达在CD38+NK细胞表面;而RA患者滑液NK细胞高表达颗粒酶、穿孔素。说明RA患者外周血和滑液NK细胞功能存在差异,外周血NK细胞趋化能力较强,而滑液中NK细胞更具杀伤能力。3.RA患者外周血和滑液NK细胞均高表达CD38分子,提示CD38分子可能参与NK细胞趋化和杀伤两种功能的调节。第三部分目的:研究CD38分子对RA患者外周血和滑液淋巴细胞功能的影响和调节机制。方法:选取6例合并单、双侧膝关节滑膜积液的RA患者,配对采集患者肝素钠抗凝新鲜外周静脉血和膝关节滑液,梯度密度离心法分离外周血和滑液淋巴细胞。体外培养,设空白对照组、IB4组(Anti-CD38 mAb)、IL-2+IB4联合刺激组,多色流式细胞仪测定NK细胞颗粒酶B、穿孔素的表达,ELISA法测定培养上清TNF-α、IL-6的浓度。脂质体CD38-siRNA转染RA患者外周血淋巴细胞,RT-PCR法检测转染效率;免疫印迹法检测刺激CD38和CD38-siRNA沉默对RA外周血淋巴细胞内磷酯酶C(PLC-y1)蛋白表达水平的影响。结果:1.RA外周血和滑液NK细胞上颗粒酶B和穿孔素表达在IB4组有上升趋势,但与空白对照组无统计学差异,联合IL-2刺激后外周血淋巴细胞和滑液淋巴细胞中NK细胞颗粒酶B和穿孔素表达水平显著提高,与空白对照组和IB4组比较,均有统计学差异(P值均小于0.05)。2.与空白对照组相比,IB4、IL-2+IB4联合刺激均显著增加了外周血淋巴细胞和滑液淋巴细胞培养上清中IL-6和TNF-α的分泌量(P值均小于0.05)。IB4组和IL-2+IB4联合刺激组之间比较无统计学差异(P>0.05)。3.无论空白对照组和IB4组、IL-2+IB4联合刺激组,滑液NK细胞上颗粒酶B和穿孔素的表达水平均显著高于外周血NK细胞,两者间有统计学差异(P值均小于0.05);而滑液淋巴细胞与外周血淋巴细胞培养上清中IL-6和TNF-α的分泌量仅在IL-2+IB4联合刺激组,两者之间存在统计学差异(P<0.05)。4.CD38-siRNA干扰处理RA外周血淋巴细胞后,RA外周血淋巴细胞内PLC-y1蛋白水平明显下降,PLC-γ1条带的灰度值低于空白对照组;而应用IB4刺激处理后,RA外周血血淋巴细胞内PLC-γ1蛋白的表达明显高于空白对照组,三组间PLC-γ1条带的灰度值均存在统计学差异(P值均小于0.05)。结论:1.刺激CD38分子能显著提高RA患者外周血和滑液中淋巴细胞分泌促炎性细胞因子的能力。2.刺激CD38分子可增强RA患者外周血和滑液NK细胞的杀伤能力;联合IL-2,这种增强作用显著放大。3.CD38可通过蛋白激酶C通路介导细胞内蛋白磷酸化,阻断CD38分子可降低胞内蛋白磷酸化水平。统计学分析:数值采用Mean±SD表示,采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。经One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test检测数据均符合正态分布;两组均数之间比较采用两独立样本t检验或配对r检验;采用单因素方差分析(One-way ANOVA)进行多组(n≥3)样本均数比较。一般线性模型分析影响指标的因素。Pearson或Spearman等级相关进行相关性分析。线性回归分析相关系数。所有试验均重复3次。检验的显著性水平定义a=0.05,P<0.05差异有统计学意义。