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癌症严重威害人类健康和生命安全,肺癌因其恶性程度高且缺乏有效的治疗手段已成为全球癌症致死的主要原因。早期肺癌患者的五年生存率高达90%,但肺癌起病隐匿,绝大部分患者首次就诊时已处于肺癌晚期,而晚期肺癌患者的生存率低于10%。目前肺癌早期筛查尚无有效的技术手段,国际上普遍推荐使用低剂量螺旋CT用于肺癌筛查,但是其高假阳性和潜在放射损伤等问题在一定程度上限制其大规模应用。最近的研究表明microRNA的异常表达与肺癌的发生和进展具有高度相关性。因此对肺癌特异性肿瘤标志物microRNA进行的高灵敏定量检测为肺癌的早期诊断提供了新的潜在方向,具有广阔的临床应用前景。临床试验结果显示,microRNA检测对肺癌的阴性预测率达到99%以上,低剂量螺旋CT联合microRNA检测在肺癌早期的大规模筛查方面显示出极大的应用前景。多项研究表明,miR-21不仅可以用于肺癌的早期诊断,而且在辅助治疗和预后方面具有很大的潜力。microRNA的传统检测技术如Northern印迹分析、RT-PCR、微阵列芯片等存在灵敏度低,操作繁琐,样本需求量大等不足,限制了其在临床实际中的应用。近年来研究人员开发了许多新型技术手段用于microRNA的定量检测。电化学技术由于灵敏度高,快速响应,检测成本低,可微型集成化等特点,与其他检测技术手段相比具有独特的优势,尤其在构建用于microRNA检测的POCT器件方面具有非常大的潜力。DNA通常作为生物识别探针固定在电极表面用于microRNA的电化学检测,电极将DNA与microRNA的杂交反应转换为可定量输出的电学信号。DNA分子结构稳定,序列可编程且可精确识别,是构建生物传感器的理想材料。纳米尺度上DNA可以自组装形成具有很好的机械刚性和稳定性的DNA四面体;宏观尺度上DNA可以交联形成具有很好的生物相容性和可降解性的DNA水凝胶。本文具体开展了以下三个方面的工作:首先,基于电化学技术和DNA纳米技术,利用DNA四面体作为识别探针设计了一种电化学检测平台实现了miR-21的检测。不同于均相体系中的碱基互补配对反应,固—液界面处的DNA杂交反应受到目标分子可及性的限制。我们合成了有序的带有茎环结构的DNA四面体探针,通过底部修饰的三个巯基官能团固定在金电极表面构建有序的自组装分子识别层,减少电极表面探针的无序构象及非特异性吸附。DNA四面体顶端延伸出的茎环结构探针用于实现对miR-21的特异性结合,茎环结构末端修饰二茂铁标记用于产生可检测的电学信号。我们对探针表面堆积密度和茎环结构信号变化模式之间的关系进行了研究。通过在金电极表面自组装低密度的DNA四面体探针,我们以较弱的检测信号为代价实现更高的杂交效率和更快的杂交动力学,构建了一种“signal-on”的电化学检测平台,减少了背景噪声对电化学检测信号的干扰,不受基准信号的限制。当检测体系中没有目标miR-21时,由于四面体具有一定的高度,标记在四面体顶端茎环结构末端的二茂铁与电极表面存在一定的距离,产生的电子传递少,背景噪声低。当检测体系中出现目标miR-21时,茎环结构的环状部分与目标miR-21发生杂交反应形成刚性双螺旋结构。在电极表面低覆盖率的情况下,DNA容易出现弹性弯曲或自由旋转移动,标记在探针末端的二茂铁与金电极表面之间的距离减小甚至可能发生直接的电子交换,产生的法拉第电流的增大值与反应体系中miR-21的数量呈正相关。所开发的电化学DNA生物传感器在使用低密度探针降低成本,省略的信号放大步骤的基础上,实现了pM浓度miR-21的检测。然后,基于电化学技术和DNA生物材料,首次将DNA水凝胶与电化学技术相结合,提出了基于DNA水凝胶的电化学生物检测平台实现了miR-21的检测。我们将末端标记有二茂铁信号分子的DNA识别探针作为交联剂,和接枝在高分子聚丙烯酰胺骨架上的侧链DNA杂交互补形成具有三维空间结构的杂化DNA水凝胶。DNA水凝胶通过共价键固定在硅烷化的ITO电极表面构建电化学检测平台。DNA水凝胶提供了一种类溶液环境,更有利于探针和目标分子之间的杂交结合。当反应体系中出现目标miR-21时,miR-21与识别探针发生杂交反应形成双螺旋结构。DNA水凝胶失去DNA交联剂发生部分水解,双螺旋结构从ITO电极表面的水凝胶中释放进入上层溶液。反应后固定在电极表面水凝胶中的二茂铁信号基团减少,从而导致电化学信号减小,电化学信号的变化值对应于反应体系中miR-21的浓度。DNA水凝胶传感器具有理想的存储稳定性,放置14天后仍保留初始信号的85.67%,并且由于水凝胶本身具有很好的形状记忆功能,可以多次干燥/吸水溶胀重复使用。此外,该DNA水凝胶被证明具有很好的特异性和选择性。最后,基于DNA水凝胶与家用血糖仪,设计了一个用于miR-21检测的POCT装置。DNA水凝胶由于其三维空间网络结构和类溶液环境,可以用于封装葡萄糖淀粉酶并保持酶的活性。当反应体系中存在目标miR-21分子时,miR-21与DNA识别探针杂交互补,使得DNA水凝胶发生部分水解,释放出封装的葡萄糖淀粉酶。葡萄糖淀粉酶进入上层溶液后,进一步水解溶液中的直链淀粉产生大量的葡萄糖分子实现信号放大。通过家用血糖仪对溶液中的葡萄糖浓度进行检测,实现对miR-21的定量检测。初步验证了miR-21浓度和血糖仪检测信号的相关性,从而证明了通过家用血糖仪构建用于microRNA定量检测的POCT设备的可行性。本文的主要贡献在于:1、合成带有茎环结构的DNA四面体探针,在金电极表面构建有序的自组装分子识别层。通过研究探针表面堆积密度和茎环结构信号变化模式之间的关系,基于低密度DNA四面体构建了一种“signal-on”的电化学检测平台,实现了pM浓度miR-21的检测。2、首次构建基于DNA水凝胶的电化学检测平台实现了对miR-21的定量检测。水凝胶传感器具有理想的存储稳定性,并且具有很好的特异性和选择性。所构建的传感器具有很好的形状记忆功能,可以多次干燥/吸水溶胀重复使用。3、基于DNA水凝胶和酶反应信号放大技术,通过便携式家用血糖仪构建了一种POCT装置用于miR-21的定量检测,有潜力用于实际临床的肺癌早期筛查。