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硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPGs)是细胞表面和胞外基质中的一种大分子。HSPGs和许多重要的生物大分子如生长因子相互作用,参与调节细胞粘附,增殖,迁移,分化,调亡,以及多种相关基因的表达等生物过程。GlcNAc N-deacetylase/N-sulfotransferase-1(NDST-1)是一种在硫酸乙酰肝素(heparan sulfate,HS)合成过程中最先进行修饰作用的酶。利用本实验室已经建立的NDST-1基因敲除小鼠模型,对该基因在胚胎发育过程中的作用进行了研究。
本文首先阐明NDST-1基因缺失小鼠表现出软骨内成骨过程迟缓的表型。综合利用组织学和免疫组织化学染色技术对该基因缺失小鼠的骨骼形成进行检测的结果显示,NDST-1的缺失导致了小鼠肢骨钙化部分缩短,软骨细胞和成骨细胞分化延迟,软骨细胞增殖加快。原位HS结合能力检测的结果表明,在突变体小鼠的指骨中BMP2,4,6和内源HS的结合能力下降,然而FGF1和内源HS的结合能力不受影响。免疫组织化学的数据显示,相对于正常小鼠,突变体小鼠的指骨中BMPR-IA,P-Smad1和PTTHrP的蛋白表达水平显著升高。但是Indian hedgehog,Gli1,Gli3,Patched和FGFR-3的表达水平却没有明显变化。而且,在NDST-1基因缺失小鼠的肢骨外植体中利用noggin抑制BMPR的信号传导,可以回复软骨细胞肥大分化过程迟缓的现象,并且,P-Smad1和PTHrP蛋白表达量升高的现象也得到了回复。这些结果提示了,NDST-1依赖性的HS有可能反向的调节了BMP及其下游的PTHrP的信号传导,由此而影响了软骨内成骨的过程。
NDST-1基因缺失还导致了小鼠肺部发育不成熟的表型。除了本实验室之前已经报道过的因肺发育不全而导致的新生小鼠呼吸窘迫死亡以外,进一步的检测显示突变体小鼠胚胎期肺的发育过程中,间质细胞增厚,肺泡的间隔增厚,终末囊泡扩张的程度不足,并且细胞的增殖速率加快。免疫荧光的实验结果表明,NDST-1基因缺失小鼠肺中,P-Smad 1和Id1的蛋白水平升高,然而BMP2,BMP4的蛋白水平降低,其转录水平没有变化。原位HS结合能力检测结果显示,NDST-1基因缺失小鼠肺中BMP2,4,6,和FGF1,10与内源HS的结合能力下降。利用从胚胎期小鼠肺中分离得到的上皮细胞和间质细胞检测BMP2的内在化过程,这一研究结果指出,突变体小鼠中BMP2的内在化过程被抑制,而这一抑制现象可以被外源添加的肝素所恢复。在体外培养的突变体小鼠胚肺中外源添加肝素或者用noggin抑制BMP信号传导都可以恢复突变体小鼠肺发育不成熟的表型,而且可以使得P-Smad1蛋白水平下降。
此外,NDST-1的基因缺失影响了FGF1所诱导的Erk磷酸化水平,然而对于Hedgehog通路相关的Patched和Gli1的蛋白水平没有影响。这些结果提示了,在肺的发育过程中NDST-1相关的HS影响了BMP和FGF的信号传导通路,它可以通过调节BMP的内在化过程,BMP配体的降解速率,以及限制用于下游信号传导的配体浓度,从而反向调整BMP的信号传导。这对于进一步的探讨HSPGs如何调节BMP信号传导的细胞及分子机制提供了重要的实验依据。
此外,NDST-1基因缺失小鼠还表现出头部,脑,眼睛,骨骼等多方面的发育缺陷。大约有4%的基因缺失小鼠表现出头部的发育畸形。具体表现为,头部变小,眼睛晶状体消失。另外,大约有38%的基因缺失小鼠的前肢存在并指的发育畸形。这说明NDST-1在胚胎期多种组织的发育过程中发挥至关重要的作用。