论文部分内容阅读
第一部分脂肪细胞应激诱导自噬的作用及机制研究目的:探讨高脂环境下自噬活性的变化及其与内质网应激的关系。方法:通过Western blot、免疫荧光、电镜三种方法检测棕榈酸负荷下分化成熟脂肪细胞自噬活性的变化;RT-PCR和Western blot方法检测内质网应激信号通路,观察自噬与内质网应激发生的先后顺序,并通过抑制内质网应激信号通路观察自噬水平的变化,明确自噬的诱导机制;通过药物性抑制自噬,分别用Western blot方法检测对细胞内质网应激信号及MTT法检测对细胞存活率的影响。结果:棕榈酸显著诱导分化成熟的脂肪细胞自噬活性的增加,表现为自噬体和自噬溶酶体形成增多,自噬特异性蛋白LC3-II的积累量增多及自噬流的增加;棕榈酸诱导内质网应激的发生且先于自噬的激活,并且抑制内质网应激导致LC3-II的积累量降低;此外,抑制自噬增加了细胞对应激和凋亡的敏感性。结论:棕榈酸激活成熟分化脂肪细胞的自噬活性增加;自噬的激活部分依赖棕榈酸诱导的内质网应激途径;自噬作为适应性反应在应激环境下增加细胞对内质网应激和细胞调亡的抵抗。第二部分自噬对脂肪细胞的炎症因子的调节作用目的:探讨自噬激活对脂肪细胞炎症因子的调节作用方法:通过免疫组化和RT-PCR方法,观察饮食诱导肥胖鼠脂肪组织及高脂诱导脂肪细胞的炎症表现以及自噬相关基因的表达,明确炎症和自噬的水平;分别通过药物性抑制和si RNA干扰自噬基因的方法阻断自噬,RT-PCR方法检测炎症因子MCP-1和IL-6的表达水平,明确自噬对炎症因子的调节作用。结果:饮食诱导肥胖鼠脂肪组织切片的H&E染色和CD68免疫组化分析结果表现为炎症细胞的浸润增加,RT-PCR方法检测棕榈酸诱导分化脂肪细胞炎症因子的表达水平上调。肥胖诱导的脂肪组织及棕榈酸诱导脂肪细胞都表现为自噬基因的表达升高。3-MA自噬特异性抑制和si RNA转染自噬相关基因Becn1干扰自噬的形成,RT-PCR法检测MCP-1和IL-6的表达水平上调。结论:在肥胖诱导的脂肪组织和单独脂肪细胞的炎症反应中自噬被激活,自噬作为应激环境下的适应性机制参与炎症反应的调节,并发挥抗炎的作用。第三部分雷帕霉素的抗应激和抗炎作用及其与自噬活性的关系目的:探讨雷帕霉素的抗应激和抗炎作用及其与自噬活性的关系方法:Western blot方法检测m TORC1信号下游磷酸化S6K1蛋白表达,观察棕榈酸对m TORC1信号的影响,同时验证雷帕霉素对脂肪细胞m TORC1信号的抑制作用。分别用雷帕霉素预处理脂肪细胞,通过Western blot和RT-PCR方法检测雷帕霉素对内质网应激信号蛋白和炎症因子及炎症通路NF-κB表达的影响;并通过药物性抑制和si RNA干扰自噬的方法进一步明确,雷帕霉素对内质网应激和炎症反应的作用与自噬的关系。结果:棕榈酸显著诱导脂肪细胞磷酸化S6K1蛋白表达增加,且可被雷帕霉素所抑制;雷帕霉素显著下调棕榈酸诱导的内质网应激信号蛋白的表达,但CQ抑制自噬消除了雷帕霉素的抗应激作用;雷帕霉素显著抑制NF-κB炎症信号及其介导的炎症因子MCP-1和IL-6的表达,si Becn1干扰自噬可部分阻断雷帕霉素的抗炎作用。结论:棕榈酸诱导m TORC1信号上调促进炎症反应的发生,雷帕霉素发挥抗内质网应激和抗炎的作用,且雷帕霉素的这些有益作用部分依赖自噬途径的激活。