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研究背景和目的:心肌纤维化(Myocardial fibrosis;MF)是多种心血管疾病的终末期表现,其主要病理表现为心肌间质中成纤维细胞(CFs)增殖、并转化为肌成纤维细胞及细胞外基质的过度沉积。胶原蛋白占细胞外基质的80%,是细胞外基质的主要成分,I型胶原蛋白(ColⅠ)、III型胶原蛋白(ColⅢ)是心肌纤维化中的主要胶原蛋白类型[1]。成纤维细胞及肌成纤维细胞被认为是心肌纤维化时合成ColⅠ、ColⅢ的主要细胞。血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)是重要的促有丝分裂因子,可促进成纤维细胞的增殖、胶原蛋白分泌,在心肌纤维化进程中起重要作用[3]。但PDGF-BB通过何种方式激活成纤维细胞介导心肌纤维化目前还不是很明确,我们前期在去氧皮质酮/盐诱导的大鼠纤维化模型中的研究发现血小板源性生长因子及其受体(PDGFs/PDGFRs)的表达均显著增加,且其主要位于成纤维细胞和肌成纤维细胞中,并且发现血小板源性生长因子受体-β(PDGFR-β)在成纤维细胞的增殖、转化、胶原分泌中起到主要作用[4,5]。PI3K/Akt信号通路是体内一条重要的调控通路,参与调控细胞在增殖、迁移、分化和血管生成等方面的功能[6]。本研究通过观察在培养纯化的CFs中加入外源性PDGF-BB干预后,观察CFs的增值、转化,检测胶原蛋白的合成及其受体和PDGFR-β/PI3K/Akt信号通路的表达,探讨PDGF-BB在心肌纤维化中的作用及其可能的下游信号机制。方法:采用胰酶消化及差速贴壁法分离纯化CFs,免疫荧光法鉴定CFs纯化的CFs随机分成以下四组:空白对照组(CON组)、PDGF-BB组(P组)、PDGF-BB+IMA组(IMA组)、PDGF-BB+LY294002组(LY组)。上述各组条件培养液培养48小时后采用MTT法测定CFs在各组的增殖情况;实时荧光定量PCR测定各组PDGFR-α、PDGFR-β、胶原蛋白I(ColⅠ)、胶原蛋白III(ColⅢ)、PI3K和Akt的m RNA含量;Western Blotting法检测各组PDGFR-β、磷酸化的PDGFR-β(p-PDGFR-β)、PI3K、磷酸化的PI3K(p-PI3K)、ColⅠ、ColⅢ的蛋白表6达情况。将CON组、P组及LY组三组细胞条件培养液培养7天后免疫荧光法检测各组细胞α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达,以检测CFs的转化情况。结果:免疫荧光双染鉴定显示培养的细胞中心肌组织波动蛋白(vimention)表达阳性的CFs达90%,α-SMA阳性细胞10%;条件培养基培养7天后荧光显微镜下观察到P组表达α-SMA的细胞高达90%,CON组几乎无表达,二者比较P<0.01,有统计学意义,LY组表达量为10%与P组比较差异有统计学意义(P<0.01)。分组培养48小时后MTT法测得P组细胞较CON组显著增加(P<0.01),而IMA组和LY组细胞较P组明显减少,差异有统计学意义(P<0.01);PDGFR-β、Col I、Col III、PI3K和AKT的蛋白及m RNA表达量在PDGF-BB刺激48小时后显著增加,与CON组比较P<0.01,给予IMA或者LY294002后通道蛋白PDGFR-β、PI3K的磷酸化明显受到抑制(P<0.05),PDGFR-β、PI3K和Akt m RNA的表达量较P组也相应明显下降(P<0.01),COl I、COl III在m RNA及蛋白水平较P组亦显著下降(P<0.01);但PDGFR-αm RNA的表达量在四组处理中未见明显变化,在给予PDGF-BB后PDGFR-β的表达量较PDGFR-α明显增加(P<0.01)。结论:1.PDGF-BB具有诱导CFs增殖及转化为肌成纤维细胞从而促进胶原蛋白合成导致心肌纤维的作用;2.PDGF-BB主要通过PDGFRβ作用于心肌成纤维细胞而与PDGFR-α无关;3.PDGFR-β/PI3K/Akt信号通路参与了PDGF-BB诱导CFs致心肌纤维化的过程。