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从本实验室构建的家蚕蛹cDNA文库中筛选得到一条cDNA片段,经NCBI比对分析,发现其含有RRM保守结构域,因此命名为Bmrrm(Bomby.mor.rrm),GenBank登陆号为DQ534196。该基因序列全长为108.bp,开放阅读框大小为894bp,采用DNAStar软件进行预测发现该基因编码297个氨基酸残基,预测分子量大小为33 kD,等电点为9.69。从GenBank等数据库中利用Blastp检索,发现在其他物种中与BmRRM同源性较高的均为一些RNA结合蛋白,我们推测其可能是家蚕中RNA结合蛋白。将Bmrrm基因cDNA序列与家蚕基因组序列进行比对,结果表明该基因具有3个外显子,2个内含子,外显子/内含子边界符合经典的GT-AG规则。
根据cDNA序列的ORF框设计上下游引物,PCR扩增后经BamHI和Xh.I双酶切,插入融合表达载体pET-28a(+)的相应酶切位点,成功构建重组融合蛋白表达质粒并转化人肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞,经PCR、酶切鉴定以及测序分析证实重组正确。用终浓度为.mM的IPTG诱导重组菌后,裂解菌体作SDS-PAGE分析,在3.kD左右的位置有一浓集特异性蛋白条带,与预期值相符。重组蛋白以可溶的形式表达,故用亲和层析的方法纯化目的蛋白His-tagBmRRM,并以纯化所得蛋白为抗原免疫雄性新西兰兔,制备了该重组蛋白的多克隆抗体。多克隆抗体经Protei.A凝胶柱纯化,ELISA检测抗血清的效价可达到1:6400以上。我们利用荧光定量PCR的方法,对家蚕卵、五龄幼虫、蛹、蛾四个发育时期,以及五龄幼虫各组织中的mRNA进行转录水平分析,实验结果表明,在蛹期和生殖腺、表皮表达量较高。提取家蚕五龄幼虫的各组织蛋白,用于Wester.blotting实验,实验结果表明,BmRRM蛋白在家蚕的卵、五龄幼虫、蛹期和生殖腺、表皮、脂肪体中均有表达,而在家蚕其他时期及组织中我们并没有检测到该蛋白的存在。以家蚕Bm5细胞进行免疫细胞化学实验,结果显示,在未分裂细胞中和处在分裂末期的细胞,BmRRM蛋白主要分布在细胞核中,少量分布在细胞质内。以上这些结果为深入研究BmRRM蛋白奠定了基础。