【摘 要】
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目的:1.在单细胞水平描绘心脏移植急性排斥反应中免疫细胞亚群的动态变化。2.研究T细胞敲除Birc5减轻小鼠心脏移植排斥反应的细胞机制和分子机制,为心脏移植急性排斥反应探索潜在的治疗靶点。方法:1.构建小鼠腹腔异位心脏移植模型,进行单细胞转录组测序,经数据过滤、样本间批次效应校正、无监督聚类、降维、可视化和细胞类型注释后,对感兴趣的细胞亚群进行差异基因分析、通路富集分析和拟时序分析。2.获取公共数
【基金项目】
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国家自然科学基金项目的资助（No. 82071803,No.81730015,No.82170504）；
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目的:1.在单细胞水平描绘心脏移植急性排斥反应中免疫细胞亚群的动态变化。2.研究T细胞敲除Birc5减轻小鼠心脏移植排斥反应的细胞机制和分子机制,为心脏移植急性排斥反应探索潜在的治疗靶点。方法:1.构建小鼠腹腔异位心脏移植模型,进行单细胞转录组测序,经数据过滤、样本间批次效应校正、无监督聚类、降维、可视化和细胞类型注释后,对感兴趣的细胞亚群进行差异基因分析、通路富集分析和拟时序分析。2.获取公共数据库的移植后人的心内膜活检标本表达谱芯片数据集,分析得到排斥反应相关的基因集,并结合本实验的单细胞数据建立基因筛选系统,得到排斥反应相关的候选基因集。3.构建小鼠心脏移植模型,流式细胞术检测同系对照组、同种异体移植组心脏移植物中CD4+T细胞和CD8+T细胞的survivin（由Birc5编码的蛋白）表达水平和Annexin V（早期凋亡）阳性比例。观察移植物生存曲线,对术后第6天心脏移植物进行H＆E染色。流式细胞术检测Treg、Th1、CD8+IFN-γ+T细胞和Annexin V+CD4+T细胞等细胞亚群的数量和比例变化。4.磁珠分选得到CD4+T细胞体外活化,用caspase-3抑制剂Ac-DEVD-CHO干预Birc5-/-CD4+T细胞,Western blot检测各组Cleaved Caspase-3和Cleaved PARP的表达水平。5.使用survivin（Birc5编码的蛋白）的小分子抑制剂YM155干预小鼠心脏移植模型,观察生存曲线和移植物切片H＆E染色;体外活化健康人的外周血单个核细胞（PBMC）体外活化,YM155处理后,流式细胞术检测CD4+T的Annexin V阳性的比例变化。结果:1.单细胞测序得到心脏移植物和脾脏中一共18 678个细胞,经无监督聚类后划分成18个细胞亚群,包含髓系细胞、B细胞、T细胞、中性粒细胞、NK细胞和成纤维细胞等6种主要细胞类型。Allo-HT中的主要髓系细胞由Ctrl-HT中的心脏驻留巨噬细胞变成了ISGhi巨噬细胞,其特征基因主要富集在迁移、趋化和对干扰素反应相关通路。Allo-HT中Ccl5hi细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）和Mki67hiCTL细胞亚群占比近一半,有着很强的增殖能力和细胞杀伤能力。2.Birc5在发生移植排斥反应的T细胞中高表达,Birc5-/-组心脏移植排斥反应显著减轻,Birc5-/-T细胞凋亡增加部分由caspase-3介导。用survivin（Birc5编码的蛋白）的小分子抑制剂YM155处理能减轻小鼠心脏移植急性排斥反应,并在体外活化实验中增加健康人PBMC的T细胞凋亡。结论:1.在单细胞水平揭示心脏移植急性排斥反应免疫细胞亚群占比的动态变化,并揭示髓系细胞、B细胞和T细胞中各细胞亚群的功能特征和分化轨迹,包括ISGhi巨噬细胞、Mki67hi CTL和Ccl5hi CTL。2.急性排斥反应心脏移植物浸润的T细胞Birc5表达上调,T细胞敲除Birc5减轻小鼠心脏移植急性排斥反应,T细胞敲除Birc5诱导凋亡增加部分由caspase-3介导。survivin（Birc5编码的蛋白）的小分子抑制剂YM155对小鼠心脏移植急性排斥反应有保护作用,Birc5可能是心脏移植急性排斥反应潜在的治疗靶点。
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