子宫内膜异位(简称内异症,EMS)是一种常见的妇科疾病,以子宫内膜出现在子宫腔以外种植、生长为特征。由于异位病灶造成盆腔解剖结构异常及盆腹腔微环境的改变,导致临床常见的慢性盆腔痛、痛经、不孕不育等症状。长期以来,人们公认的经血逆流学说,也不能解释大多数妇女月经周期中发生经血逆流,却只有10%～15%的妇女罹患EMS[1-2]。随着研究不断深入,推测免疫缺陷、遗传和表观遗传学因素在决定个体是否发生疾病中可能起到更加关键的作用。在正常情况下,逆流至盆腔的子宫内膜被机体免疫系统识别为“异物”所清除,而在内异症患者的盆腹腔内,局部免疫微环境很可能发生了改变。越来越多的研究显示子宫内膜异位症(简称内异症)患者盆腹腔局部免疫微环境异常,不仅不能有效清除异位灶子宫内膜间质细胞(ESC),且促进其生长种植。近来研究提示IL-10+Th17细胞具有调节功能。我们发现内异症患者腹腔液存在高水平Th17细胞及IL-17A,Ⅲ-Ⅳ期患者有更高水平IL-10,提示随疾病进展,呈现促炎和耐受并存并偏向耐受的过程。我们新近发现异位灶ESC和巨噬细胞高表达IL-27,可诱导naive T向IL-10+Th17细胞分化,但分子机制及其在内异症发展中的作用尚不清楚。故本课题在体外模拟内异症盆腹腔微环境,和体内动物实验为研究手段,拟研究ESC和巨噬细胞来源的IL-27通过何种信号通路和下游转录因子介导这群Th17细胞分化,进一步解析这群细胞是否通过IL-17A和IL-10促进内异症进展及病理机制。第一部分子宫内膜异位症患者腹腔免疫微环境特征目的 1.分析生育期健康女性及子宫内膜异位症患者盆腹腔免疫微环境免疫特征。2.促炎性IL-17A及耐受性IL-10细胞对子宫内膜间质细胞功能的调控。方法分别收集生育期健康女性及子宫内膜异位症患者腹腔液,应用离心法分离腹腔免疫细胞和腹腔液,采用Flow Cytometry检测腹腔液免疫细胞亚群特征,Cytometric Bead Array、ELISA技术检测腹腔液细胞因子(IFN-γ,TNF-α、IL-1β、IL-17A、IL-10、IL-21、IL-6、IL-4)表达特征。结果流式细胞术研究发现,CD4+Th17及Treg细胞在腹腔微环境中共同存在。Th17细胞在疾病早期明显升高,在疾病晚期没有进一步增高的趋势,而Treg细胞随着疾病进展,比例逐渐升高,在疾病晚期比例达到高峰；NK细胞主要在EMS的Ⅰ-Ⅱ期明显升高。Cytometric Bead Array研究发现,在EMS的Ⅰ-Ⅱ期,促炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-1β等明显升高,此外,Th17细胞相关效应因子及分化相关因子如IL-6和TGF-β水平也明显升高；在EMS的Ⅲ-Ⅳ期,抗炎细胞因子如IL-10和IL-4则明显升高。结论子宫内膜异位症早期(Ⅰ-Ⅱ期)以促炎性免疫应答为主,炎症贯穿疾病始终,随着疾病进展,晚期(Ⅲ-Ⅳ期)抗炎性免疫应答逐渐产生,逐渐形成免疫耐受优势格局。第二部分经异位灶ESCs训导的单核巨噬细胞对Th17细胞分化发育的影响目的1.体外模拟子宫内膜异位灶微环境的分子特征。2.经异位灶ESC训导的单核巨噬细胞对Th17细胞及IL-1 0+Th17细胞分化发育的调节机制。方法原代培养正常(Normal ESCs),在位(Eutopic ESCs)及异位子宫内膜间质细胞Ectopic ESCs),免疫磁珠分选女性外周血单核细胞及外周幼稚T细胞,细胞纯度鉴定>95%。将3种不同的ESCs分别与外周血单核细胞共培养,建立E-M共培养系统,单核细胞单独培养或经过LPS(100ng/ml)、PGE2(1uM)处理。培养48小时后,无菌收集各组培养上清,利用无菌离心技术分离上清和“训导后”分化的单核巨噬细胞,采用Bio-plex Array技术检测上清GM-CSF,MCP-1, RANTES,IL-1β,IL-27,IL-6, TGF-β1,IL-10及TNFα分泌水平；将E-M共培养系统中3种不同单核巨噬细胞分别与自体幼稚T细胞共培养,建立M-T直接共培养系统或利用transwell建立间接共培养系统；经过3种不同ESCs的训导后的腹腔单核巨噬细胞与自体幼稚T细胞共培养5-7天后,利用流式细胞术分析CD4+Th17分化发育比例。在上述模型基础上,正常ESCs与单核细胞共培养体系中加入PBS,rhIL-27或中和性抗体αIL-27,或单核细胞直接用rhIL-27,PGE2,LPS处理48小时,将训导后的单核细胞分别与自体幼稚T细胞共培养5-7天后,流式细胞术分别检测总CD4+Th17以及IL-10+Th17细胞分化发育比例。采用免疫组织化学、流式细胞术,分别检测Normal ESCs,Eutopic ESCs及Ectopic ESCs的IL-27p28表达水平；免疫磁珠分选女性外周血单核细胞,细胞纯度鉴定>95%,体外培养的外周血单核细胞,经TCDD或雌孕激素处理48小时后,采用流式细胞术检测IL-27p28表达水平。结果Bio-plex Array技术分析发现,不同ESCs与外周血单核细胞共培养过程中,ectopic ESCs组分泌高水平的IL-27,TGF-β1,GM-CSF,RANTES,其中GM-CSF促进单核细胞分化成熟,而RNATES则招募更多的单核巨噬细胞至异位灶局部。异位灶高表达IL-27以及Thl7分化相关因子如TGF-β1、IL-6。Eutopic ESCs共培养组分泌较低水平的RNATES,IL-27,TGF-β1。LPS刺激显著增加单核细胞分泌IL-27,而PGE2对IL-27的分泌无影响。流式细胞术分析发现经eutopic ESC训导的单核巨噬细胞能够诱导总CD4+Th17细胞分化,而eutopic ESC训导的单核巨噬细则抑制总CD4+Th17细胞分化,但促进IL-10+Thl7细胞分化,尤其在两者直接接触共培养条件下。E-M共培养体系中加入rhIL-27,训导后的单核巨噬细胞抑制总CD4+Th17细胞分化,而促进IL-10+Th17细胞分化：反之,E-M共培养体系利用αIL-27拮抗rhIL-27后,特异性促进IL-10+Th17细胞分化的效应消失。经重组IL-27处理的单核细胞特异性促进IL-10+Th17细胞分化,PGE2及LPS则无此效应。采用免疫组织化学及流式细胞术检测发现异位灶间质细胞高表达IL-27；外周血单核细胞经TCDD或雌孕激素处理48小时后,高表达IL-27。与normal ESCs相比,ectopic ESCs表达更高水平IL-27,eutopic ESCs表达低水平的IL-27。结论体外模拟的异位灶微环境高表达IL-27,IL-6, TGF-β1因子。异位灶间质细胞高表达IL-27；微环境中雌孕激素或微环境毒物亦可促进异位灶间质细胞或单核巨噬细胞高表达IL-27；经异位灶间质细胞或重组IL-27训导后单核巨噬细胞抑制总Th17细胞分化,而特异性诱导IL-10+Th17细胞分化。第三部分 异位灶IL-27间接抑制促炎性Th17细胞分化发育的分子机制目的1.过表达IL-27的ESCs与单核细胞共培养,体外模拟异位灶微环境,解析巨噬细胞功能表型变化。2.经过表达IL-27的ESCs所处理的单核巨噬细胞间接调控Th17细胞的分化。方法构建人IL-27过表达质粒,使用QIAGEN高效原代细胞转染试剂,将IL-27过表达质粒转染原代培养的ESCs,转染24小时后,免疫磁珠分选女性外周血单核细胞及幼稚T细胞,单核细胞与转染后ESCs共培养。共培养48小时后,收集共培养体系中1/2“训导过”的单核巨噬细胞,加入Trizol,提取RNA；余下1/2"训导过”的单核细胞与幼稚T细胞共培养,5天后,免疫磁珠再次分离单核细胞与T细胞,将收集纯化的T细胞中加入Trizol,提取RNA。采用Affymetrix的Human Gene 2.0 ST Array芯片检测进行差异mRNA筛选。体外培养单核细胞,加入IL-2或IL-27的中和性抗体,利用ELISA及流式细胞术对上述结果进行验证。利用IntAct数据库预测Aiolos与Foxp3关系。结果基于Gene array数据分析显示,经过表达IL-27的ESC“训导”后,单核巨噬细胞表达更高水平的IL-27和IL-2；IL-2通过上调T细胞SHC1和DOK2表达,进而降低Thl7细胞相关转录因子IKZF3(Aiolos)表达,抑制促炎性Th17细胞分化；体外细胞实验证实, 当"M-E"共培养体系中拮抗IL-27或IL-2分子,“训导”后的单核巨噬细胞可上调T细胞IKZF3表达,与基因结芯片分析结果一致。我们利用IntAct数据库预测,发现Aiolos与Foxp3之间是负性调控关系,Aiolos可抑制Foxp3表达与功能,推测Aiolos可能介导局部微环境中Th17与Treg分化平衡的偏移。结论异位灶微环境中IL-27促使单核细胞进一步高表达IL-27和IL-2,通过IL-2抑制T细胞相关转录因子IKZF3(编码Aiolos)表达,抑制IL-17A+Th17细胞分化,或者可能影响Th17/Foxp3+Treg的分化平衡,间接介导免疫耐受微环境的形成。第四部分异位灶IL-27直接调控IL-10+Th17细胞分化发育的分子机制目的 1.解析IL-27对CD4+IL-10+T细胞分化的影响。2.解析IL-27直接调控IL-10+Th17分化发育的分子机制。3.动物实验验证。方法原代培养正常(normal ESCs),在位(eutopic ESCs)及异位子宫内膜间质细胞(ectopic ESCs),采用免疫组织化学、流式细胞术,分别检测normal ESCs, eutopic ESCs及ectopic ESCs的IL-27p28表达水平；免疫磁珠分选女性外周血单核细胞或幼稚T细胞,细胞纯度鉴定>95%，a-CD3/a-CD28预包被96孔板4℃孵育16小时,IL-6,IL-27,TGF-β1单独或联合组合,以及IL-27不同浓度条件下,在96孔上直接极化naive T细胞5天。利用流式细胞术分析总CD4+Th17细胞以及IL-10+Th17细胞的分化发育比例或PD-L1表达,并筛选出IL-27最佳作用浓度。在Thl, Th2,Treg,Thl7诱导极化条件下,利用流式细胞术分析各亚群细胞c-MAF表达水平。我们构建IL-27, RORC2及c-MAF过表达载体；通过查阅文献及在线数据库预测,我们挑选并克隆了与IL-27相关的候选基因Blimp-1,c-MAF, IL-17A, LAG3的启动子区,并插入pGL3-basic载体中,构建6个荧光素酶报告基因载体。培养HEK293T细胞,使用高效真核转染试剂QIAGEN,将1L-27,RORC2及c-MAF过表达质粒,以及候选荧光素酶报告基因载体质粒,分别转染HEK293T细胞,48小时后,采用Promega公司的双报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。在Th0, Th17, Th17+rhIL-27, Th17+a-IL-27极化条件下,分别极化naive T细胞7天,提取RNA后,利用Real time PCR技术对上述结果进行验证。利用Pathway Commons Project, KEGG, Pathway Interaction Database 及 IntAct数据库,预测IL-27下游基因调控关系和信号转导通路。动物实验体内验证：利用C57小鼠建模,分为ctrl组,IL-27拮抗组,IL-17A拮抗组,IL-10拮抗组,IL-17A及IL-10联合拮抗组,每组6只,10%水合氯醛麻醉后,将小鼠自体子宫切为均匀4块,约2*2*2cm大小,用7/0丝线缝在下腹部及盆腔腹膜上,5/0丝线缝合腹部伤口。术后2mg/L 17β-雌二醇溶液肌注1次,腹腔分别注射中和性抗体50ug,抗生素连续肌注3天预防感染。1周后,重复腹腔注射中和性抗体50ug；2周后通过颈椎脱臼法处死建模小鼠,纵行剖开小鼠腹腔,收集每只小鼠异位病灶,比病灶较大小并拍照。结果IL-6+TGF-β1诱导较高比例的总CD4+Th17细胞分化,及低水平的IL-10+Th17细胞。与IL6+TGF-β1组相比,IL-27抑制总CD4+Th17细胞分化,但能够特异的诱导其中IL-10+Thl7细胞分化。IL-6, IL-27, TGF-β1三者在诱导IL-10+Th17细胞分化中没有协同作用。在TGF-β1存在条件下,IL-27仍然能够以剂量依赖方式抑制总CD4+Th17细胞分化,同时特异性诱导IL-10+Th17细胞分化。IL-27也能抑制GM-CSF诱导的总CD4+Th17细胞分化。流式细胞术研究显示,与Thl相比,c-MAF在Th2,Treg以及Th17中显著高水平表达；与IL-10-Th17细胞相比,IL-10+Th17细胞表达更高水平c-MAF。我们根据双荧光素酶报告基因实验及实时荧光定量PCR实验结果,基于Pathway Commons Project, KEGG,Pathway Interaction Database及IntAct数据库,预测IL-27下游基因调控关系和信号转导通路。当微环境中存在IL-6及TGFp时,通过STAT3活化诱导RORC转录因子,进而促进1L-17A等Th17相关效应因子的表达；RORC可能部分活化负性调控子c-MAF,具有潜在活化PRDM1和IL-10表达的能力。当IL-27单独极化T细胞时,IL-27通过活化STAT1抑制RORC表达,或通过c-MAF部分拮抗RORC表达,抑制Th17细胞分化；与此同时,IL-27主要诱导表达c-MAF转录因子,最终启动PRDM1的表达,诱导IL-10分泌。IL-6、TGFβ,IL-27同时存在于微环境中,一方面IL-6及TGFβ通过STAT3诱导RORC/IL-17A表达,另一方面,IL-27强化STAT1和c-MAF通路,抑制Th17细胞转录因子RORC表达,通过c-MAF/PRDM1通路促进Th17细胞表达IL-10。动物实验证实,拮抗腹腔中IL-27,能够抑制异位灶IL-10+Th17细胞的分化。结论异位灶ESCs高表达IL-27;TCDD及雌孕激素促进单核细胞高表达IL-27；IL-27可直接抑制naiveT向总CD4+Th17田胞分化,但特异性促进IL-10+Th17细胞分化；当Th17极化背景下同时存在IL-27,IL-27抑制促炎性Th17细胞分化,同时还通过MAF/PRDM1通路促进IL-10表达,特异性诱导IL-10+Th17细胞分化,参与调控Th17细胞功能可塑性及微环境免疫耐受偏移。第五部分IL-10+Th17细胞参与子宫内膜异位症的发病机制目的 1.人重组IL-17A对ESC的生物学行为调控。2.人重组IL-17A联合IL-10对ESC的生物学行为调控。3.动物实验验证。方法分别收集正常生育期健康女性及子宫内膜异位症正常、在位子宫内膜组织及腹腔异位灶组织,应用胶原酶消化、密度梯度离心法分离、培养正常,在位及异位子宫内膜间质细胞(ESCs)。流式鉴定ESCs自身IL-17AR的表达。体外培养并饥饿处理6小时后,分别用不同浓度IL-17A、IL-10、IL-17A联合IL-10处理48小时,采用磺酰罗丹明B(Sulforhodamine B, SRB)七色法检测细胞活力,Annexin V-FITC/PI检测凋亡；利用Transwell检测ESCs侵袭能力,粘附试验盒检测粘附能力.动物实验体内验证：利用C57小鼠建模,分为ctr1,1L-27拮抗组,IL-17A拮抗组,IL-10拮抗组,IL-17A及IL-10联合拮抗组,每组10只,10%水合氯醛麻醉后,将小鼠自体子宫切为均匀4块,约2*2*2cm大小,用7/0丝线缝在下腹部及盆腔腹膜上,5/0丝线缝合腹部伤口。术后2mg/L 17β-雌二醇溶液肌注1次,腹腔分别注射中和性抗体50ug,抗生素连续肌注3天预防感染。1周后,重复腹腔注射中和性抗体50ug;2周后通过颈椎脱臼法处死建模小鼠,纵行剖开小鼠腹腔,收集每只小鼠异位病灶并利用流式细胞术检测异位病灶IL-10+Th17细胞的分化发育水平。结果ESCs表达IL-17A的受体；单独IL-17A促进3种ESCs细胞活力,促进正常ESCs及在位eutopic ESCs凋亡,而抑制异位ectopic ESCs凋亡；单独IL-17A促进正常ESCs及在位eutopic ESCs侵袭能力,抑制异位ectopic ESCs侵袭能力；而单独IL-17A均降低3中ESCs的粘附能力。而单独IL-10可增加正常ESCs的细胞活力,粘附能力和侵袭能力；IL-17A及IL-10联合则进一步增加正常ESCs的细胞活力和侵袭能力。动物实验证实,同时拮抗盆腹腔中IL-17A及IL-10因子,能够显著抑制异位灶生长。结论IL-10+Th17细胞通过功能分子IL-10和IL-17A促进EMS进展。结论综上所述,我们发现内异症患者腹腔液存在高水平Thl7细胞及IL-17A,Ⅲ-Ⅳ期患者有更高水平IL-10,提示随疾病进展,呈现促炎和耐受并存并偏向耐受的过程。IL-27分子在异位灶免疫微环境中发挥以下作用： 1)异位灶ESC和巨噬细胞高表达IL-27；(2)ESC和巨噬细胞来源的IL-27通过c-MAF转录因子和Blimp-1通路直接介导幼稚T细胞向IL-10+Th17细胞分化；(3)高表达IL-27的ESC诱导外周血单核细胞进一步高表达IL-27,并向类M2型单核巨噬细胞分化；(4)IL-27上调类M2型单核巨噬细胞IL-2表达,进而下调Th17细胞中IKZF3(Aiolos)表达；(5)IKZF3(Aiolos)可能拮抗Foxp3,介导局部微环境中Th17与Treg分化平衡的偏移；(6)IL-10+Th17细胞通过特征性功能分子IL-10和IL-17A促进EMS进展。因此,异位灶微环境中IL-27作用于单核巨噬细胞和T细胞,在病灶局部产生利于免疫耐受的微环境。本课题为Th17细胞在子宫内膜异位灶微环境中的分化发育中阐明了新的分子机制,为解析子宫内膜异位症的致病机理提供新的研究方向,为寻找防治内异症的新策略提供科学依据。