猪的体细胞核移植(克隆)技术在种质资源保护、良种繁育，人类器官移植异种供体和疾病模型制备、辅助生殖技术质控、药物蛋白生产，以及生殖与发育基础研究等方面的成功应用，显示出其在畜牧业、医学和生物学等方面具有广阔的应用前景。然而，由供体细胞核表观遗传重编程不彻底等因素所导致的猪体细胞克隆效率低下，极大地限制了该技术的进一步推广。表观遗传学事件主要包括DN A甲基化和组蛋白修饰，其中后者又包括组蛋白的甲基化、乙酰化、糖基化、磷酸化、泛素化和SUMO化等。研究显示，利用恰当的DN A甲基化/去甲基化表观遗传修饰剂处理供核细胞或者克隆胚胎，可显著改善重编程并提高克隆效率。借助 H3K79甲基转移酶 DOT1L特异性抑制剂 EPZ004777(EPZ)干预，可促进小鼠诱导多能干细胞的获取效率及质量提高，表明 H3K79二甲基化(H3K79me2)可能参与调控细胞多能性。那么，H3K79me2是否参与了着床前克隆胚发育调控目前未见报道。因此，本研究以猪为研究对象，首先试图揭示猪 H3K79me2在猪克隆胚早期发育期间的动态变化，再结合EPZ处理，探讨表观修饰剂干预 H3K79me2重编程对猪克隆胚发育的影响，为今后最终阐明 H3K79me2参与细胞发育命运调控的分子机制提供依据。具体试验和结果如下：　　试验一旨在揭示猪胚胎着床前发育期间 H3K79me2的重编程规律。以相应发育时期的猪体外受精胚胎(in vitrofertilization, IVF)为对照，利用H3K79me2抗体的间接免疫荧光技术，检测了不同发育阶段的猪体细胞克隆(SCNT)胚胎中 H3K79me2的信号变化。结果发现，在猪IVF和SCNT胚胎中，H3K79me2信号均在起点到原核胚期间从较高水平显著降低至消失，至桑椹胚信号重新出现，囊胚期进一步增强。所不同的是，在IVF胚胎中EXPB到HB阶段H3K79me2表达水平趋于平缓，而在SCNT胚胎中从 EXPB到 HB阶段 H3K79me2表达水平依然持续上升。另外，从原核期(16hpa NTE和18hpi IVFE)至8-cell阶段，H3K79me2在两种胚胎中的信号均降至最低点，而在起始阶段和桑椹胚之后IVFE中的H3K79me2信号水平均高于NTE。结果表明，猪体细胞克隆胚着床前发育期间H3K79me2重编程异常。　　试验二目的是探讨EPZ对猪SCNT胚胎着床前体外发育的影响，将SCNT胚随机置于分别添加0.5nM、5nM、50nMEPZ的PZM-3和1‰ DMSO(v/v)的PZM-3(对照组)自化学激活起处理24 h，根据各组胚胎的卵裂率、囊胚率及囊胚总细胞数来评价其效果。结果发现：各组卵裂率无差异；0.5nM组囊胚率显著高于对照组(28.97±2.65％ vs.17.13±2.69%)；就囊胚总细胞数而言，各组均无明显变化，但50nM组有降低的趋势。随后，选取含0.5nM EPZ的PZM-3，自化学激活起，分别孵育猪克隆胚胎12h、24h、36h(对照组处理0h)。结果显示，各组卵裂率无显著差异，而12h和24h处理组的囊胚率均显著提高(28.56±3.51%，28.34±3.00% vs.16.32±1.93%，17.93±0.64%)。在囊胚总细胞数上，除36 h处理组显著降低外，其余三组之间无差异。以上结果说明，0.5nM EPZ处理12-24h可改善猪克隆胚胎的早期发育，而处理浓度过高或时间过长都可能损害胚胎发育。　　试验三旨在探明EPZ是否是通过调节 H3K79me2重编程，进而有助于猪SCNT胚胎原核期H3K79me2重编程。以IVF胚胎和未经EPZ处理的各期SCNT胚胎为对照，在0.5nM EPZ处理后，检测了1-细胞发育不同时期的SCNT胚胎其H3K79me2变化，以及处理4 h后重构胚 DOT1L基因的表达变化。结果发现，IVF胚胎中，H3K79me2水平在受精后4h内迅速降低，6hpi进一步降低，至10hpi信号消失；对照组H3K79me2的水平从电刺激活至4hpa阶段缓慢降低，到8hpa信号消失；而经EPZ处理组胚胎H3K79me2水平则从2hpa开始降低，4hpa继续下降，至8hpa信号消失。DOT1L基因在0.5nM EPZ处理组中表达量较对照组有所降低，但不显著。结果表明，0.5nM EPZ处理部分抑制了DOT1L基因的表达，进而下调H3K79me2水平，改善了SCNT胚胎的H3K79重编程，从而有助于克隆胚的着床前发育。　　试验四的目的是进一步明晰EPZ促进猪SCNT胚胎体外发育的可能分子机制。检测了0.5nM EPZ处理12h和24h后发育而来的猪SCNT囊胚不同时期(根据其形态分为EB、EXPB以及HB) H3K79me2水平，与IVF囊胚、非EPZ处理的SCNT囊胚相应阶段H3K79me2比较。结果发现，经EPZ处理后，SCNT囊胚中H3K79me2水平变化趋势大体上与非EPZ处理的SCNT囊胚一致，虽然比非EZP组有所增加，但还达不到IVF囊胚的H3K79me2水平。之后检测了EPZ处理12h、24h来源 SCNT囊胚及对照组 SCNT囊胚中相关基因(自我更新基因 OCT4、SOX2、LIN28以及分化基因CDX2、GATA4)的表达。结果显示，在源于EPZ处理的SCNT囊胚中，OCT4、CDX2和GATA4表达量均显著上调；SOX2在12h处理组中显著高于对照组，24h组与对照组相比无明显差异，Lin28则相反。两处理组来源的囊胚，其CDX2和GATA4无差异；SOX2和LIN28在处理12h组中显著高于24 h组，OCT4则相反。　　综上所述，本文首次对猪SCNT和IVF胚胎着床前发育期间H3K79me2重编程规律进行了研究，揭示了H3K79me2在猪早期胚胎的全基因组表达模式。发现0.5nM EPZ处理12h或24h通过微调H3K79me2表达模式，显著促进猪SCNT胚胎着床前发育；结果表明，H3K79me2可能参与调控猪SCNT胚胎早期胚胎发育命运。研究结果进一步丰富了猪克隆胚生产培养方案，为加快该技术的应用推广奠定了一定的基础。当然，EPZ干预对猪克隆胚体内发育的影响有待进一步研究。