研究目的:芒果苷是一种天然的黄酮类化合物,已有文献[1]表明芒果苷可以抑制鼻咽癌细胞的增殖,但其作用机理尚未清楚。本研究通过运用体外细胞培养法,经不同浓度的芒果苷处理人鼻咽癌CNE2细胞,作用不同时间后用细胞毒理试验观察芒果苷对细胞增殖的影响;用流式细胞术检测细胞周期分布情况及可能的凋亡变化;运用定量PCR和Western blot检测凋亡相关基因Bcl-2和Bax mRNA及其蛋白表达水平的改变,以探讨芒果苷对人鼻咽癌CNE2细胞生物学行为的影响及其可能的作用机制,为芒果苷在鼻咽癌治疗中的临床研究应用提供实验依据。研究方法:(1)参照相关文献[2]及广西民族医院临床实验中心提纯芒果苷的方法[3],采用乙醇渗漉法从芒果树的叶子提取纯化出芒果苷。经外观鉴别、显微镜观察、化学性质测定、紫外光谱扫描、高效液相色谱、高效毛细管电泳法鉴定该芒果苷的理化性质和纯度。用二甲基亚砜(DMSO)将芒果苷溶解,配制成一系列不同浓度的溶液,用于以下的体外细胞实验。(2)人鼻咽癌CNE2细胞来自广西医科大学实验中心耳鼻喉实验室。采用10%胎牛血清的RPMI1640培养液常规体外培养方法培养细胞。待CNE2细胞生长至密度为70-80%时,加入一系列含不同浓度的芒果苷的培养液,以不加药物溶液的做空白对照。分别作用1,3,5天后,放置于倒置显微镜下观察细胞形态及数量的改变;同时应用细胞增殖-毒性检测试剂盒(CCK-8法)检测细胞的抑制率。(3)常规体外培养方法培养CNE2细胞,待细胞生长至密度为70-80%时,加入一系列含不同浓度的芒果苷的培养液作用三天后,①荧光显微镜下观察细胞发生凋亡的情况;②采用流式细胞术(Flow cytometry;FCM)分析其细胞周期及凋亡率的变化。(4)同样处理的细胞用芒果苷培养液作用三天后,①收集细胞,提取总RNA,逆转录成cDNA,运用定量PCR检测凋亡相关基因Bcl-2和BaxmRNA表达水平的改变;②收集细胞,提取总蛋白,运用Western blot检测Bcl-2和Bax蛋白含量的变化。研究结果:采用乙醇渗漉提取法从广西本地特色资源芒果树叶中分离制备芒果苷,经鉴定,纯度达到97.4%,接近Sigma标准品的水平。采用CCK-8法检测浓度为0,12.5,25,50,100,150及200μmol/L芒果苷分别作用鼻咽癌CNE2细胞1、3、5天后细胞的增殖情况。结果发现,随着芒果苷浓度的增加,细胞增殖受到不同程度的抑制,其抑制率也随之增大,其中200 μmol/L芒果苷作用细胞5天的抑制率为55.9%。由此表明芒果苷对鼻咽癌CNE2细胞的增殖有一定抑制作用,且呈现剂量、时间相关关系。在显微镜下观察发现,随着芒果苷作用时间的增加,细胞的数目不再增加,集落形成受到抑制,透光度降低,细胞间隙扩大,细胞变小变圆,整体轮廓不清,细胞离壁,聚集成团,漂浮。芒果苷作用浓度越大的实验组细胞的改变表现越明显。采用AnnexinV-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测同步化处理的细胞,在荧光显微镜下观察,发现在芒果苷作用1天和3天后,随着浓度的增加,细胞膜呈现绿色荧光的细胞数目增多,呈红色荧光的细胞数目减少,表明细胞正处于凋亡早期,而细胞发生死亡或处于凋亡晚期的情况较少。同步化处理三天的细胞经流式细胞术检测细胞周期分布及凋亡的情况,发现随着芒果苷浓度的增加,细胞凋亡率增加,G2/M期比例上升,其作用呈现剂量-效应相关性。芒果苷能干扰鼻咽癌CNE2细胞的生长周期,使细胞停滞于G2-M期,同时诱导细胞发生早期凋亡。其中浓度为200μmol/L芒果苷作用3天的现象最明显,细胞凋亡率为44.1%,G2/M期为14.6%。提取芒果苷同样处理三天的细胞总RNA,利用逆转录-实时定量PCR检测细胞内Bcl-2和Bax基因的mRNA表达水平;同时提取细胞总蛋白,运用Western Blot检测细胞内Bcl-2和Bax蛋白的表达水平。结果显示芒果苷能下调Bcl-2基因表达的水平,而相对上调Bax基因表达的水平,且呈现剂量相关性。说明芒果苷诱导鼻咽癌CNE2细胞发生凋亡有可能是通过调控细胞内Bcl-2与Bax蛋白的比例来实现的。结论:(1)芒果苷能抑制鼻咽癌CNE2细胞的生长,并呈现剂量、时间相关性。(2)芒果苷对鼻咽癌CNE2细胞生长的抑制作用与其诱导细胞在G2/M期停滞并发生早期凋亡有关,其机制可能是通过能下调Bcl-2蛋白表达水平,而相对上调Bax蛋白表达水平而进行。