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目的:长久以来,癌症一直被誉为人类健康的“第一大杀手”。结直肠癌（colorectal cancer,CRC）是第三大常见的肿瘤,也是消化道肿瘤内发病率排名第二位的恶性肿瘤。根据美国国家癌症研究所的监测数据,在2019年中,结直肠癌约有145,600例发病病例,且有51,012例新增死亡病例。在我国,结直肠癌发病率数十年来逐渐递增,位于男性罹患癌症发病的第三位,女性中第二位。随着国民经济水平提高,饮食结构的改变,结直肠癌的发病年龄逐渐走低,青少年与中青年的患病人数已然增长。然而,许多结直肠癌患者在诊断之时已经发展为恶性晚期并伴有多发转移,如果能够实现肿瘤的早期诊断可大大降低肿瘤的发病率。目前结直肠癌的治疗方式多以外科手术切除为主辅助化疗药物的应用;癌症患者往往预后差,复发率高,不足40%的患者生存期超过5年。近些年来,根据肿瘤特异性筛查靶点研发的靶向药物与精准治疗得到巨大突破,在多种肿瘤中得到了较好的疗效。但肿瘤的发生发展是个多变复杂的过程,受多种因素的影响;目前,结直肠癌的病理机制尚未研究透彻,又缺乏有效的治疗靶标和生物标志物。因此,深入研究其发生机制、筛选出特异性的治疗靶点与生物标志物,具有重大的研究意义。非编码RNA构成了人类基因组转录的大部分产物,研究发现它可以通过影响转录、表观遗传等方式调控基因表达,引发一系列生物过程的改变。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种新型的内源性非编码RNA,广泛存在于真核生物转录组中,且稳定表达于胞质内。CircRNA的结构特征为5’端与3’端通过共价键连接得到闭合环状结构,这种结构的特殊性使其不易被降解。CircRNA最早发现于RNA病毒中,曾在一段时间内被认为是转录错误的产物。随着高通量RNA测序以及单细胞测序技术的发展,人们发现circRNA大量存在于哺乳动物细胞内,提示circRNA可能具有重要的生物学功能,因此开始了对circRNA的研究。目前已知circRNA参与了包括肿瘤、心血管疾病、阿尔兹海默症、糖尿病等在内的多种疾病的病理进程。最近的研究表明,circRNA在多种消化道肿瘤如胃癌、肝癌、结直肠癌组织中存在差异表达,通过作为微小RNA海绵、RNA结合蛋白海绵、甚至编码多肽或蛋白质,参与肿瘤细胞的增殖、侵袭转移、凋亡以及上皮间质转化等生物学进程。CircRNA结构的特殊性使其更稳定,且在外泌体和血浆中均能够被检测到,因此被认为是一种理想的新型生物标志物。但是,大多数circRNA在CRC中的生物学功能依旧未知。在本研究中,我们鉴定出结直肠癌组织与癌旁组织中差异表达的circRNA（DECs）,并通过构建circRNA/miRNA/mRNA调控网络对DEC的功能进行预测,同时对hsacirc0001550在CRC中的生物学作用加以验证。方法:1、失调circRNA的筛选与鉴定:选取两对来源于结直肠癌患者癌组织与癌旁组织样本,通过Illumina测序平台进行RNA深度测序,使用Burrows-Wheeler中的MEM算法将测序结果与人类基因组进行比对,鉴定出癌与癌旁组织中差异表达的circRNA（***p<0.05,log 2 fold change>2.0）。将我们的测序数据与GSE116589芯片数据（n=2）联合分析,选择在癌组织中同时上调且差异倍数明显的circRNA作为候选circRNAs,并进一步扩大样本（n=25）在成对的结直肠癌组织和CRC细胞系中进行表达量的验证。2、Circ RNA/miRNA/mRNA调控网络的构建与功能预测:首先,我们通过CSCD数据库分析候选circRNA的可能作用机制。然后使用Starbase数据库预测circRNA和miRNA的相互作用并进一步分析了这些miRNA在CRC中的表达,选择在CRC中下调的miRNA作为circRNA的靶标（log 2 fold change<0.5,p<0.05及FDR<0.05）。应用Starbase数据库预测候选miRNA的靶mRNA并选取与circRNA存在共表达的mRNA作为候选mRNA。使用GEPIA数据库进一步分析CRC组织中候选mRNA的表达情况,并选择上调的mRNA作为mi RNA的靶标。最后应用Cytoscape3.2.1软件构建circRNA-miRNA-mRNA功能调控网络。通过使用David数据库对circRNA调控的靶基因进行富集分析预测失调circRNA的功能。通过String数据库分别构建核心circRNA所调控的基因的蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络。3、Hsacirc0001550在CRC中的功能验证:构建hsacirc0001550沉默与过表达质粒,转染至HCT116和SW480两株CRC细胞系中。通过MTT增殖实验检测hsacirc0001550对CRC细胞增殖的作用;通过流式检测技术分析hsacirc0001550对结肠癌细胞周期、细胞分裂和细胞凋亡的影响。结果:1、通过RNA-seq测序分析,我们筛选出76个在结直肠癌成对组织中显著差异表达的circRNA,其中包括33个上调的DECs和43个下调的DECs。这些DECs主要分布在NC000005.10（chr5,14.5%）,NC000009.12（chr9,9.2%）,NC000001.11（chr1,6.6%）,NC000004.12（chr4,6.6%）和NC000014.9（chr14,6.6%）五条染色体上。DECs的序列长度在201bp至76919bp之间,主要为200bp-600bp（68.4%）以及超过2000bp（19.7%）。亲本基因的GO与KEGG富集结果显示这些DEGs的亲本基因的功能主要富集于:组织与细胞分化增殖调控;MAPK通路、G-蛋白偶联受体PIK3-AKT通路、Ras信号通路和蛋白质加工及炎性反应等方面。2、基于RNA-seq数据和GSE116589数据联合分析我们得到23个在CRC中差异表达的circRNA,包括6个上调DECs和17个下调的DECs。六个上调的circRNA分别为hsacirc0030632,hsacirc0004887,hsacirc0001550,hsacirc0001681,hsacirc0002970和hsacirc0006528,而下调的circRNA包含hsacirc0002947,hsacirc0003553等。3、Hsacirc0030632,hsacirc0001550和hsacirc0001681在六种CRC细胞系（HCT116、SW620、SW480、HT-29、RKO、CACO2）中的表达量显著高于其在正常肠上皮细胞HIEC中的表达量。且相较于癌旁组织,hsacirc0030632,hsacirc0001550和hsacirc0001681在结肠癌组织中显著高表达。4、通过CSCD数据库分析预测hsacirc0030632,hsacirc0001550和hsacirc000168都具有miRNA反应元件（MRE）,提示其可能作为miRNA海绵发挥生物学作用。我们构建了circRNA-miRNA-mRNA调控网络,包括5个miRNA（hsa-miR-664b-3p,hsa-miR-139-5p,hsa-miR-370-3p,hsa-miR-181a-5p和hsa-miR-181b-5p）和54个靶mRNA。Hsacirc0030632调控的mRNA主要富集于DNA损伤的信号转导、细胞周期G1/S转换的调控、线粒体凋亡、嘌呤核苷酸的补救合成等通路。Hsacirc0001681调控的mRNA富集于核质转运和病毒过程。而hsacirc0001550所调控的mRNA则主要富集于细胞分裂与形成、磷酸戊糖支路等信号通路。PPI网络中的核心蛋白CCT2、HSPD1、TALDO1、RPIA和PPP1CA等均参与了癌症相关通路的富集。5、HCT116和SW480中过表达hsacirc0001550后,细胞增殖能力增强,细胞增殖指数增加,细胞凋亡水平下降;在HCT116和SW480中沉默hsacirc0001550后,CRC细胞增殖能力受到抑制,细胞增殖指数减小,细胞凋亡水平增加。结论:1、基于RNA-seq数据和GSE116589 CircRNA芯片测序分析后,在CRC种鉴定出6个上调DECs和17个下调的DECs。DECs主要分布于NC000005.10（chr5）,NC000009.12（chr9）,NC000001.11（chr1）,NC000004.12（chr4）和NC000014.9（chr14）五条染色体上。DECs的序列长度在201bp至76919bp之间,主要为200bp-600bp以及超过2000bp。2、成对CRC扩大样本（n=25对）及6株CRC细胞进一步验证发现Hsacirc0030632,hsacirc0001550和hsacirc0001681的表达量在结肠癌组织和细胞系中显著表达上调。3、生物信息学分析提示hsacirc0030632、hsacirc0001550和hsacirc0001681可通过ceRNA机制靶向吸附miRNA调控下游mRNA的表达;同时,这三个circRNA主要通过参与细胞周期、细胞凋亡、端粒酶活性、DNA损伤等生物学过程促进结肠癌的发生发展和病理进程。4、在HCT116和SW480 CRC细胞中,沉默Hsacirc0001550表达可显著CRC细胞增殖,促进其凋亡,反之亦然,提示其在CRC中扮演着致癌基因的角色。