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姜黄素[1,7-二(4-羟基-5-甲氧基)苯基-1,6-庚二烯-3,5二酮)是从姜科植物姜黄(Curcuma Longa L.)分离出的酚类化合物,在印度和中国有着悠久的传统药物的使用历史。药理作用研究表明,姜黄素具有抗肿瘤,抗肝纤维化,抗炎,抗微生物,抗氧化和抗病毒等生物活性。姜黄素在临床试验中用于治疗各种类型的癌症,包括肝癌,结肠癌,多发性骨髓瘤,胰腺癌等。但由于其水溶性差,口服吸收较少,致使生物利用度低,限制其临床应用。寡肽转运蛋白1(oligopeptide transporter 1,PepT1)是一种低亲和力,高转运能力的转运蛋白,主要转运二肽和三肽,属于质子依赖型寡肽转运载体(POT)家族成员。PepT1已成为一个引人注目的药物设计目标,因为一些吸收不良的药物可以修饰成基于PepT1的肽前体药物,以改善膜通透性,最终提高母体药物口服吸收。本论文以姜黄素为研究对象,基于PepT1设计合成了10个新的姜黄素二肽衍生物,并对10个化合物进行结构鉴定。采用HPLC法测定姜黄素及其二肽衍生物的溶解度。通过荧光法优化姜黄素及其二肽衍生物的摄取条件并进行摄取评价;采用LC-MS/MS法测定细胞内药物的含量,建立Caco-2细胞transwell小室模型测定药物跨膜转运量;通过体外代谢模型(大鼠肝微粒体酶孵育)进一步了解其代谢情况。采用人肝星状细胞LX-2和肝癌细胞HepG-2和SMMC-7721进行活性评价。研究内容具体如下:一、姜黄素二肽衍生物合成及溶解度测定选择了甘氨酸、缬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸设计合成了 10个姜黄素二肽衍生物(5a-5j)。采用DCC法缩合得到10个二肽,利用三氟乙酸脱去二肽氨基端的Boc保护,氯乙酰氯作为连接链连接姜黄素和二肽,最后通过LiOH脱去羧基端的甲酯基的保护得到1 0个姜黄素二肽衍生物。通过HRMS-ESI、1H NMR与13C NMR对化合物进行结构确证。采用HPLC法对各个化合物进行纯度检查,测定化合物平衡度溶解度及化学稳定性。结果表明10个新合物溶解度和稳定性较姜黄素都有所提高。二、姜黄素及其二肽衍生物吸收评价采用体外Caco-2细胞模型,对姜黄素和10个化合物进行吸收评价。1、通过倒置荧光显微镜观察药物进入细胞过程;采用荧光法测定细胞中药物的荧光强度,优化摄取条件,确定最佳摄取时间为60 min,药物浓度为100 μM;对姜黄素及化合物5a-5j在Caco-2细胞的摄取情况进行评价。结果表明5d和5e表现出比姜黄素更强的荧光强度,其余化合物与姜黄素相比无显著性差异。通过加入PepT1经典底物Gly-Sar作为抑制剂,姜黄素的摄取不受Gly-Sar的影响,而5d和5e的摄取被Gly-Sar显著削弱。2、建立测定细胞裂解液中姜黄素及其二肽衍生物浓度的LC-MS/MS法,分析姜黄素及化合物5d和5e在Caco-2细胞的摄取量以及有抑制剂Gly-Sar存在下摄取量的变化。结果表明与姜黄素相比,化合物5d和5e有更高的细胞摄取量。通过添加PepT1经典底物Gly-Sar作为抑制剂,姜黄素的摄取量不受Gly-Sar的影响,但5d和5e的摄取呈现剂量依赖性地抑制,提示化合物5d和5e的细胞摄取可能是由于结构存在二肽而被寡肽转运蛋白PepT1识别并摄取。3、建立了Caco-2细胞Transwell小室模型来考察姜黄素、化合物5d和5e的跨膜转运情况。根据测定的表观渗透系数(Papp),化合物5d和5e分别是姜黄素的1.5倍和2.8倍,5e透膜吸收明显优于姜黄素。5d和5e的累计转运量明显高于姜黄素,在Gly-Sar的参与下转运量显著性降低,进一步证明化合物5d和5e的吸收增加是由于PepT1介导的。4、为了探讨化合物5d和5e是否可能是姜黄素的前药,构建大鼠肝微粒体体外孵育模型,以NADPH供氢进行Ⅰ相代谢研究,以UDPGA为糖基供体进行葡萄糖醛酸结合反应,采用液相色谱-高分辨质谱(UFLC-QTOF-MS)法分析原型药物及其代谢代谢产物。结果表明化合物5d和5e的代谢产物中均检测到姜黄素;化合物5d和5e在肝微粒体中检测到四氢、六氢等还原产物以及葡萄糖醛酸结合产物,提示化合物5d和5e有可能作为姜黄素的前药,但有待于进一步研究。三、姜黄素及其二肽衍生物生物的活性评价在研究抑制肝星状细胞增殖活性方面,通过MTT法评估了姜黄素及其二肽衍生物在体外对人肝星状细胞LX-2细胞抗增殖活性,大多数衍生物表现出有效的抗增殖活性,尤其是化合物5e的IC50值在LX-2中为13.08μM,其表现出比姜黄素更高的效力(IC50=22.62μM)。为了探索这些姜黄素及其二肽衍生物的抑制肝癌细胞增殖活性方面,通过MTT法评估其在体外对人肝癌细胞系HepG2和SMMC-7721的抗增殖活性。大多数衍生物表现出有效的抗增殖活性,尤其是化合物5e的IC50值在HepG2和SMMC-7721中分别为23.35和19.67μM,其表现出比姜黄素更高的效力(HepG2:IC50=35.81,SMMC-7721:IC50=22.89μM)。化合物5d(HepG2:IC50=40.25,SMMC-7721:IC50=35.40μM)显示出与姜黄素相似的活性。