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家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)是养蚕过程中常见的血液型脓病的病原。家蚕感染BmNPV后期体内流出白色血液,每年给养蚕业带来巨大经济损失。目前研究者已培育出一些对BmNPV具有高度抗性的家蚕品种,如华康一号、华康二号、野三元N等。但家蚕抵抗BmNPV的分子机理尚不明确。本研究前期基于不同抗性品系家蚕添食BmNPV后的转录组学数据分析筛选出的一些凋亡相关基因(Bmcytc、Bmapaf-1、Bmcaspase-Nc、Bmcaspase-1)。细胞色素C是哺乳动物线粒体凋亡通路上游关键因子,细胞受到外界不良刺激后,线粒体膜通透性发生改变,凋亡相关因子Cytc等被释放到细胞质中,与凋亡酶激活因子(Apaf-1)结合形成凋亡小体,经过下游Caspase家族级联调控激活凋亡执行蛋白Caspase-3,引起凋亡。对于家蚕细胞色素C研究也取得一些进展,用紫外线刺激BmN细胞后会出现细胞凋亡,细胞色素C被释放到细胞质。在BmNPV刺激作用下,家蚕Bmcytc是否会通过调控线粒体凋亡通路引发细胞凋亡来参与应答病毒侵染尚不明确。本研究主要通过dsRNA和过表达载体在细胞水平对Bmcytc进行功能研究,获得如下结果。首先,对Bmcytc序列进行生物信息学分析,了解Bmcytc的分子特征。序列分析结果显示Bmcytc核苷酸序列包含一个122 bp的5’端UTR、一个159 bp的3’端UTR和一个长324 bp的开放阅读框(ORF),编码108位氨基酸,包含一个Cytc保守结构域(位于第8-107氨基酸)。蛋白同源比对分析结果显示Bmcytc与其他物种Cytc具有较高同源性,系统进化树结果显示Bmcytc在进化中趋于保守。因而推测Bmcytc和其他物种Cytc功能类似,Bmcytc可能参与线粒体凋亡通路的调控。对Bmcytc进行时空表达谱分析发现,家蚕Bmcytc在中肠和头部组织中高表达,发育到蛾期时表达量最高。对家蚕经口感染BmNPV后进行组织表达谱分析发现,抗性品系AN家蚕中肠、血淋巴、马氏管和脂肪体Bmcytc表达无明显差异,易感品系p50家蚕的Bmcytc表达在中肠、血淋巴和脂肪体组织中被抑制,在马氏管则升高。为探究Bmcytc对凋亡下游基因的调控作用,分别利用Bmcytc的dsRNA和过表达载体 pIZT/V5-His-mCherry-Bmcytc 在 BmN 中进行 RNAi 和过表达分析,用 qRT-PCR方法检测Bmcytc和选取凋亡相关基因的表达情况。定量结果表明Bmcytc被RNAi处理后,Bmapaf-1、Bmcaspase-Nc和Bmcaspase-1均呈现基因表达下调。Bmcytc被过表达后,Bmapaf-1、Bmcaspase-Nc表达出现上调。与此同时,在细胞水平对Bmcytc进行RNAi和过表达,用可在BV中表达EGFP的重组改造病毒BV-EGFP(budded virus containing EGFP-tagged)侵染BmN细胞,在不同时间点用荧光显微镜观察绿色荧光信号,并用qRT-PCR检测病毒增殖情况。对Bmcytc进行RNAi后,用荧光显微镜观察发现病毒感染24 h后各组间荧光信号没有差异,在感染48 h和72 h后Bmcytc被RNAi的实验组中荧光信号明显强于对照组,同时细胞伴随裂解。相对定量结果显示病毒处理24 h后,各组中病毒核衣壳蛋白基因vp39的表达没有差异,在病毒处理48 h和72 h后实验组中vp39基因显著上调,证实病毒增殖被促进。接着对Bmcytc进行过表达后用BV-EGFP侵染BmN细胞,通过荧光显微镜观察发现病毒处理24 h后,Bmcytc过表达的实验组中荧光信号少于对照组,但在48 h和72 h实验组中荧光信号强于对照组。用qRT-PCR技术检测病毒增殖情况,结果显示病毒处理24 h后,实验组中vp39基因表达出现下调,表明在病毒感染早期增殖被抑制。在病毒处理48 h和72 h后实验组中vp39基因表达出现显著上调,表明病毒在感染后期被促进增殖。为了验证病毒侵染过程中Bmcytc是否通过介导线粒体通路诱导细胞凋亡参与BmNPV应答,用凋亡抑制剂处理已经被过表达Bmcytc的BmN,结果显示Bmcytc参与的凋亡通路被抑制后,病毒增殖被促进。为了探究个体水平细胞凋亡是否参与BmNPV侵染应答,选用了不同BmNPV抗性家蚕品系p50和AN,分别利用凋亡诱导剂和凋亡抑制剂处理后进行BmNPV接种,通过检测vp39基因的表达了解病毒的增殖情况。结果发现凋亡被抑制后BmNPV增殖被促进,凋亡被诱导后BmNPV增殖被抑制,与细胞水平得到的结果一致。本研究结果为揭示家蚕Bmcytc抵抗BmNPV分子机理提供数据支撑,完善了家蚕线粒体凋亡通路研究内容,为家蚕抗病品种的培育提供理论参考。