目的:神经祖细胞(Neural progenitor cells,NPCs)增殖、分化、产生新生神经元,参与神经功能活动的过程称为神经发生。成年神经发生主要存在于海马齿状回(Dentate gyrus,DG)和室管膜下区。成年海马神经发生涉及学习,记忆和情绪调节。然而,随着年龄的增加NPCs增殖和分化能力降低,出现神经发生障碍,是神经退行性疾病发生的关键事件。运动可促进海马神经发生,提高小鼠的认知功能,但其具体机制尚不清楚。我们的前期结果表明NPCs的年龄相关的功能障碍可能与蛋白酶体失活相关,因此推测运动促进海马神经发生可能通过蛋白酶体活性的激活。本课题围绕这一假设进行推理,运用在体和离体实验,深入解析运动诱导成年海马神经发生的分子机制,为临床上预防和治疗年龄相关性疾病提供新的策略。第一部分自主跑轮运动对海马蛋白酶体活性的影响方法:1.不同年龄的BALB/c小鼠P0(<24 h)、P90(3 months)和P300(10 months)新鲜分离海马组织,分别检测半胱氨酸酶样活性(Caspase-like activity,C-L),胰蛋白酶样活性(Trypsin-like activity,T-L),糜蛋白酶样活性(Chymotrypsin-like activity,CT-L);q PCR检测与C-L,T-L和CT-L蛋白酶体活性相关的蛋白酶体亚单位β1(Proteasome subunit beta type 1,PSMB1)、β2(Proteasome subunit beta type 2,PSMB2)、β5(Proteasome subunit beta type 5,PSMB5)的表达。2.成年小鼠(P90)随机分为自主跑轮运动组(Runner)和静坐对照组(Sedentary),分别跑轮运动2 weeks、4 weeks、8 weeks,记录每天运动量,新鲜分离海马组织检测三种蛋白酶体活性;q PCR检测海马与C-L,T-L和CT-L蛋白酶体活性相关的蛋白酶体亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB5的表达。结果:1.随着年龄的增加海马C-L蛋白酶体活性,T-L蛋白酶体活性,CT-L蛋白酶体活性均下降;而且q PCR检测与C-L,T-L和CT-L蛋白酶体活性相关的蛋白酶体亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB5的表达也随着年龄的增加而降低。2.成年小鼠(P90)自主跑轮运动2 weeks后,运动组和静坐组相比,CT-L蛋白酶体活性升高约1.4倍(P<0.01),C-L蛋白酶体活性上调约1.3倍(P<0.05),CT-L蛋白酶体活性升高最显著,q PCR检测海马蛋白酶体亚单位PSMB1、PSMB2、PSMB5的表达,PSMB5升高约1.3倍,PSMB2上调约1.2倍,PSMB1的表达无明显变化,其中PSMB5升高最明显。成年小鼠自主跑轮运动4 weeks和8 weeks后,CT-L蛋白酶体活性均升高约1.2倍。这些结果表明自主跑轮运动能够促进海马CT-L和C-L蛋白酶体活性,CT-L蛋白酶体活性升高最显著,运动4 weeks后CT-L蛋白酶体活性升高逐渐趋于稳定。3.成年小鼠(P90)自主跑轮运动2 weeks和8 weeks后,进行运动总距离和CT-L蛋白酶体活性的相关分析。在运动2 weeks内,运动距离与蛋白酶体活性呈正相关(r=0.5,P=0.08)。然而,运动8 weeks后,运动距离与蛋白酶体活性没有相关性(r=0.19,P=0.68),这些结果表明长时间的运动并没有导致CT-L蛋白酶体活性的进一步增强,反而逐渐趋于稳定,这与长时间运动后CT-L蛋白酶体活性检测结果趋于稳定相一致。因此,我们选择CT-L蛋白酶体活性的升高平台期——自主跑轮运动4 weeks,进行以下实验。第二部分运动上调IGF-1激活糜蛋白酶样活性对成年小鼠海马神经发生及学习记忆的影响方法:1.成年BALB/c小鼠(P90)随机分为自主跑轮运动组(Runner)和静坐对照组(Sedentary),自主跑轮运动4 weeks后,Elisa检测成年小鼠血清及海马IGF-1的含量。2.体外分离培养成年小鼠(P90)海马NPCs,加入不同浓度IGF-1作用,Brd U和Tuj1免疫荧光染色检测NPCs增殖和分化能力,同时检测NPCs的CT-L蛋白酶体活性及蛋白酶体亚单位PSMB5的表达。3.成年小鼠(P90)腹腔注射IGF-1受体(IGF-1R)抑制剂picropodophyllin(PPP)及其溶剂对照10%DMSO,20 mg/kg,每天注射2次,连续注射4weeks,同时进行自主跑轮运动后,分离海马组织检测CT-L蛋白酶体活性;在自主跑轮运动开始的第一天腹腔注射Brd U(100 mg/kg/d),连续注射7 days,同时进行自主跑轮运动及腹腔注射PPP 4 weeks后,灌注取脑,冰冻切片,Ki67,DCX,Brd U/DCX免疫荧光染色检测NPCs增殖、分化和存活能力;应用Ymaze自发交替及新物体识别行为学检测海马学习记忆能力。结果:1.成年小鼠自主跑轮运动4 weeks后,Elisa检测成年小鼠血清及海马IGF-1含量发现,运动组血清和海马IGF-1含量较静坐组分别上调1.3倍(P<0.05)和1.2倍(P<0.01);q PCR结果显示自主跑轮运动后海马IGF-1 m RNA的表达升高1.3倍(P<0.05)。这些结果表明运动能够上调血清和海马IGF-1的含量。2.体外分离培养成年小鼠海马NPCs,不同浓度的IGF-1 20,50和100 ng/m L作用后,Brd U掺入实验结果显示随着IGF-1浓度的升高,NPCs的增殖能力呈上升趋势,其中IGF-1 50 ng/m L和100 ng/m L分别上调1.4倍(P<0.05)和1.7倍(P<0.001);Tuj1免疫荧光染色显示IGF-1 50 ng/m L和100 ng/m L作用后分别较对照组上调1.4倍(P<0.05)和1.6倍(P<0.001);蛋白酶体活性检测结果显示,IGF-1 50 ng/m L和100 ng/m L的CT-L蛋白酶体活性升高,同时q PCR结果也显示IGF-1作用后PSMB5 m RNA的表达也升高;提示IGF-1作用后,激活成年海马NPCs的CT-L蛋白酶体活性,促进NPCs增殖与分化能力。3.成年小鼠自主跑轮运动同时每天腹腔注射2次IGF-1R抑制剂PPP及溶剂对照10%DMSO(20 mg/kg)4 weeks,海马CT-L蛋白酶体活性检测结果显示,PPPrunner组小鼠海马CT-L蛋白酶体活性较DMSO-runner降低30%(P<0.05);提示抑制IGF-1作用后,海马CT-L蛋白酶体活性降低。4.Ki67、DCX免疫荧光染色显示PPP-runner组小鼠海马DG区Ki67阳性细胞数为219.6±72.3,较对照DMSO-runner组(319.2±101.5)呈下降趋势(P=0.08);自主跑轮运动PPP组小鼠海马DG区DCX阳性细胞数为650.2±195.9较对照DMSO-runner组DCX阳性细胞数991.4±258.9显著降低(P<0.05);同时,应用Metamorph分析DCX阳性细胞的突起长度结果显示,PPP-runner组海马DG区DCX阳性细胞突起的平均长度为65.6μm±14.0μm,小于DMSO-runner对照组103.0μm±22.2μm(P<0.01),具有显著的统计学差异。这些结果表明,PPP抑制IGF-1作用后,能够抑制海马DG区NPCs的增殖和分化能力。Brd U/DCX免疫双标表示小鼠海马DG区NPCs的存活能力。成年小鼠连续7 days腹腔注射Brd U 100 mg/kg/d后,自主跑轮运动及腹腔注射PPP 4 weeks,Brd U/DCX免疫双标结果显示,PPP-runner组海马DG区Brd U/DCX双阳性细胞数为128.2±41.2,较DMSO-runner对照组246.1±82.5明显下降(P<0.05),提示PPP抑制IGF-1作用后,海马DG区NPCs的存活能力降低。5.应用Y-maze自发交替及新物体识别行为学检测海马学习记忆能力。Y-maze自发交替实验结果显示,PPP-runner组和DMSO-runner对照组的Y-maze的入臂次数即活动度没有差异,但PPP-runner组Y-maze自发交替正确率较DMSO-runner对照组显著降低(P<0.05)。新物体识别检测在训练期间,PPP运动组与DMSO对照运动组探索物体所花费的时间相似,表明两组小鼠的活动度相似;在检测时期,PPP运动组探索新物体的时间百分比为61.2%±8.5%较DMSO对照运动组69.7%±7.9%明显下降(P<0.05)。这些结果均表明,PPP抑制IGF-1的作用后,能够抑制成年小鼠海马的学习和空间记忆能力。第三部分IGF-1/Nrf2对成年小鼠自主跑轮运动后海马神经发生及学习记忆的影响方法:1.应用Western blot检测自主跑轮运动4 weeks后,成年小鼠(P90)海马组织Nrf2核转位情况。2.体外分离培养成年小鼠(P90)海马NPCs,加入IGF-1作用,Nrf2免疫荧光染色检测Nrf2核转位情况。3.体外培养小鼠N2a细胞,作为工具细胞研究IGF-1,Nrf2及CT-L活性之间的关系。不同浓度的IGF-1作用于N2a细胞,检测CT-L蛋白酶体活性,Western blot检测Nrf2核转位情况。4.体外培养N2a细胞,Lipofectamine?RNAi MAX转染试剂转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 48 hours后,加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,检测CT-L蛋白酶体活性。5.N2a细胞过夜贴壁,待其达到70%-80%的融合,Turbofect转染试剂共转染质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3-Myc3-Nrf2及其对照质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3 48 hours后,加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测转录因子Nrf2对蛋白酶体亚单位PSMB5的转录情况。N2a细胞过夜贴壁,待其达到70%-80%的融合,Turbofect转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 8 hours后共转染质粒PSMB5-Luciferase和Renilla作用48 hours,再加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测转录因子Nrf2对蛋白酶体亚单位PSMB5的转录情况。6.成年BALB/c小鼠(P90)双侧海马立体定位注射AAV-sh RNA-Nrf2及其对照AAV-sh RNA-SC 1μL/侧(2-3 x 1012/m L),注射5 weeks后,随机分为AAVsh RNA-Nrf2自主跑轮运动组和AAV-sh RNA-SC自主跑轮运动组,进行自主跑轮运动4 weeks,检测海马CT-L蛋白酶体活性,免疫荧光染色检测两组海马齿状回颗粒下层Ki67、DCX的表达水平,观察敲减Nrf2对海马CT-L蛋白酶体活性及对NPCs增殖和分化能力的影响;应用Y-maze自发交替及新物体识别行为学检测海马学习记忆能力。结果:1.成年小鼠(P90)自主跑轮运动4 weeks后,海马Western blot检测Nrf2的表达情况,结果显示,自主跑轮运动组Nrf2核转位较对照组上调1.3倍(P<0.001),提示自主跑轮运动能够促进成年海马Nrf2核转位。2.体外分离培养成年(P90)海马NPCs,传代诱导其贴壁,不同浓度的IGF-1(50,100 ng/m L)作用后,Nrf2免疫荧光染色结果显示,IGF-1实验组Nrf2核转位较对照组升高1.4倍(P<0.001),提示IGF-1作用后NPCs的Nrf2转录活性升高。3.不同浓度IGF-1(10,20,50和100 ng/m L)作用于N2a细胞后,提取N2a细胞核浆蛋白,Western blot结果显示,IGF-1 100 ng/m L组Nrf2转录活性较对照组升高1.2倍(P<0.01);CT-L蛋白酶体活性检测结果显示,IGF-1 20,50,100ng/m L作用组CT-L蛋白酶体活性分别提高1.2倍(P<0.05)和1.3倍(P<0.001),提示IGF-1作用N2a细胞后,N2a细胞的Nrf2转录活性增加,CT-L蛋白酶体活性升高。4.成年小鼠(P90)自主跑轮运动及腹腔注射IGF-1抑制剂PPP 4 weeks后,提取海马组织核浆蛋白,Western blot结果显示PPP-runner组小鼠海马Nrf2核转位较DMSO-runner降低20%(P<0.05),表明PPP抑制IGF-1后,能够抑制自主跑轮运动诱导的海马Nrf2的核转位。这些结果表明,Nrf2作为IGF-1下游的效应分子,参与CT-L蛋白酶体活性的激活。5.体外培养N2a细胞,Lipofectamine?RNAi MAX转染试剂转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 48 hours后,加入IGF-1 100 ng/m L作用24 hours,CT-L蛋白酶体活性检测结果显示,IGF-1作用后CT-L蛋白酶体活性上调1.4倍(P<0.001);然而,在IGF-1作用后,敲减Nrf2能够显著降低CT-L蛋白酶体活性(P<0.05)。当仅敲减Nrf2后,与对照组相比CT-L蛋白酶体活性无变化。这些结果表明在IGF-1的作用下,Nrf2才能够激活CT-L蛋白酶体活性。6.N2a细胞共转染质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3-myc3-Nrf2及其对照质粒PSMB5-Luciferase,Renilla,pc DNA3 48 hours后,加入IGF-1作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测结果显示过表达Nrf2后,PSMB5的转录活性升高3.5倍(P<0.05);IGF-1作用后,过表达Nrf2组PSMB5的转录活性较对照组升高6.5倍(P<0.05),提示IGF-1作用后过表达Nrf2能够进一步促进PSMB5的转录活性。Turbofect转染Nrf2-si RNA及其对照si RNA 8 pmol 8 hours后,共转染质粒PSMB5-Luciferase和Renilla 48 hours,IGF-1 100ng/m L作用24 hours,双荧光素酶报告系统检测结果显示,IGF-1作用后,PSMB5的转录活性上调1.4倍(P<0.05);然而,在IGF-1作用后,敲减Nrf2能够显著降低PSMB5的转录活性(P<0.01)。当仅敲减Nrf2后,与对照组相比PSMB5的转录活性无变化。这些结果表明在IGF-1作用下,Nrf2才能促进蛋白酶体亚单位PSMB5的转录。7.成年BALB/c小鼠(P90)双侧海马立体定位注射AAV-sh RNA-Nrf2及其对照AAV-sh RNA-SC 1μL/侧(2-3 x 1012/m L);注射后5 weeks后,自主跑轮运动4weeks,CT-L蛋白酶体活性检测结果显示AAV-sh RNA-Nrf2组CT-L蛋白酶体活性较AAV-sh RNA-SC对照组降低30%(P<0.05),提示敲减Nrf2后,能够抑制海马蛋白酶体活性。8.Ki67、DCX免疫荧光染色结果显示,AAV-sh RNA-Nrf2运动组小鼠海马DG区Ki67阳性细胞数为195.4±85.0较对照AAV-sh RNA-SC运动组海马DG区Ki67阳性细胞数303.8±97.2减少(P<0.05);自主跑轮运动AAV-sh RNA-Nrf2组小鼠海马DG区DCX阳性细胞数为554.6±238.8较对照AAV-sh RNA-SC运动组海马DG区DCX阳性细胞数887.2±297.2显著降低(P<0.05)。同时应用Metamorph分析DCX阳性细胞的突起长度结果显示,AAV-sh RNA-Nrf2运动组海马DG区DCX阳性细胞突起的平均长度42.0μm±8.4μm,小于对照AAVsh RNA-SC运动组64.2μm±15.4μm(P<0.01),具有统计学差异。这些结果表明,敲减Nrf2后,能够抑制海马DG区NPCs的增殖和分化能力。9.Y-maze自发交替实验和新物体识别实验主要评鉴小鼠的空间学习记忆能力。Ymaze自发交替实验结果显示AAV-sh RNA-Nrf2运动组和对照AAV-sh RNA-SC运动组的Y-maze的入臂次数即活动度没有差异,但AAV-sh RNA-Nrf2运动组Y-maze自发交替正确率较对照AAV-sh RNA-SC运动组显著降低(P<0.05)。而且,新物体识别实验在训练期间,AAV-sh RNA-Nrf2运动组和对照AAV-sh RNASC运动组探索物体所花费的时间相似,表明两组小鼠的活动度相近;在检测时期,AAV-sh RNA-Nrf2运动组探索新物体的时间百分比较对照AAV-sh RNA-SC运动组下降15%(P<0.05)。这些结果表明,敲减Nrf2后,能够抑制成年小鼠海马的学习和空间记忆能力。结论:1随着年龄的增加海马CT-L蛋白酶体活性,C-L蛋白酶体活性,T-L蛋白酶体活性均下降;自主跑轮运动2 weeks后,海马CT-L蛋白酶体活性和C-L蛋白酶体活性升高,其中CT-L蛋白酶体活性升高最显著,且自主跑轮运动4 weeks后,CT-L蛋白酶体活性升高趋于稳定。2自主跑轮运动上调IGF-1的含量;IGF-1作用于离体培养NPCs后能够激活CT-L蛋白酶体活性,促进成年小鼠NPCs的增殖、分化和存活能力。3抑制IGF-1作用后,能够抑制海马CT-L蛋白酶体活性的升高,减弱运动诱导的神经发生及认知功能的改善。4 IGF-1作用于离体培养NPCs及N2a细胞后,能够诱导Nrf2核转位,上调蛋白酶体亚单位PSMB5的转录活性,激活CT-L蛋白酶活性。5敲减Nrf2后,能够抑制海马CT-L蛋白酶体活性的升高,减弱IGF-1诱导的神经发生及认知功能。