论文部分内容阅读
目的:研究核因子E2相关因子2(NRF2)-抗氧化应答元件(ARE)信号通路在过氧化氢(H2O2)致小鼠成骨前体细胞(MC3T3-E1)分化损伤中的作用;观察白藜芦醇(Res)的干预影响并探讨其可能机制。方法:1.CCK-8法检测不同浓度H2O2对MC3T3-E1细胞存活率的影响后分为对照(NC)组、200μM H2O2(200H)组、400μM H2O2(400H)组,各组干预24h后分别提取m RNA与蛋白,用实时定量PCR(RT-PCR)及Western blot(WB)分别检测细胞1型胶原(COL1)、Runt相关转录因子2(RUNX2)、NRF2、血红素加氧酶-1(HO-1)、NAD(P)H:醌氧化还原酶1(NQO1)、过氧化氢酶(CAT)m RNA及蛋白表达水平。H2O2干预24h后更换培养液诱导成骨分化,第7天行碱性磷酸酶(ALP)染色评估细胞早期成骨分化状态,第21天行茜素红染色评估细胞矿化程度;2.观察抑制NRF2-ARE信号通路对H2O2致成骨分化损伤的影响:分为NC组、400H组、NRF2特异性抑制剂ML385(M)组、400μM H2O2+ML385(400H+M)组,M组及400H+M组用5μM ML385预处理12h,各组在H2O2干预6h时用流式细胞术或荧光显微镜检测各组细胞活性氧(ROS)水平,后按前述方法检测NRF2-ARE信号通路及成骨分化与矿化指标。3.观察Res干预下H2O2致成骨分化损伤及NRF2-ARE信号通路的影响:CCK-8法检测不同浓度Res对细胞存活率的影响后分为NC组、400H组、400μM H2O2+0.1μM Res(400H+0.1R)组、400μM H2O2+1μM Res(400H+1R)组、400μM H2O2+5μM Res(400H+5R)组、400μM H2O2+5μM N-乙酰半胱氨酸(NAC)(400H+5N)组;H2O2干预前行Res或NAC预处理细胞12h,同前述方法检测各组细胞ROS水平,COL1、RUNX2、ALP、骨钙素(OCN)、NRF2、HO-1、NQO1、CAT的m RNA或蛋白表达水平,评估细胞早期成骨分化状态与矿化程度。4.抑制NRF2-ARE信号通路对Res抗H2O2致成骨分化损伤的影响:细胞分为对照组、400H组、400H+1R组、400μM H2O2+1μM Res+5μM ML385(400H+1R+M)组,Res干预前行ML385预处理细胞12h,再行Res及后续H2O2干预,同前述方法检测各组细胞ROS水平、NRF2-ARE信号通路以及成骨分化与矿化指标。结果:1.与NC组相比,H2O2组MC3T3-E1细胞COL1、RUNX2 m RNA与蛋白表达水平显著降低,ALP染色与矿化程度显著减低,NRF2、HO-1、CAT、NQO1mRNA与蛋白表达水平显著升高,400H组较200H组变化更明显(均P<0.05);2.与NC组相比,400H组ROS水平显著升高;与400H组相比,400H+M组细胞NRF2、HO-1、NQO1、CAT、COL1、RUNX2 mRNA与蛋白表达水平均显著降低,ALP染色与矿化程度显著减低,ROS水平明显升高(均P<0.05);M组较NC组上述指标差异无统计学意义;3.与400H组相比,各Res组与NAC组细胞Col1a1、Runx2 m RNA表达水平显著升高,RUNX2、COL1、ALP、OCN蛋白表达水平显著升高,ALP染色与矿化程度显著增高,ROS水平显著降低(均P<0.05),各Res组、NAC组上述指标两两组间差异无统计学意义;与400H组相比,各Res组NRF2、HO-1、CAT、NQO1 m RNA与蛋白表达水平显著升高(P<0.05),400H+5N组显著降低(P<0.05),各Res组间差异无统计学意义。4.与400H+1R组相比,400H+1R+M组细胞NRF2、HO-1、NQO1、CAT、RUNX2、COL1、ALP、OCN蛋白或m RNA表达水平显著下调,ALP染色与矿化程度显著增高,细胞ROS水平显著升高(均P<0.05)。结论:1.H2O2致MC3T3-E1细胞成骨分化损伤过程中伴有NRF2-ARE信号通路的活化,该通路的活化一定程度上减轻了MC3T3-E1细胞成骨分化的氧化损伤,其机制可能与NRF2-ARE信号通路的抗氧化作用有关;2.白藜芦醇可缓解H2O2导致的MC3T3-E1细胞成骨分化损伤,其机制可能与白藜芦醇进一步激活NRF2-ARE信号通路,抑制H2O2诱导的ROS水平升高有关。