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猪体内脂肪沉积是一个非常复杂的过程,而脂肪细胞的分化是脂肪形成的第一步,其分化的分子机制非常复杂,到目前为止尚未完全研究清楚。MicroRNAs(miRNAs)是近几年来发现的内源性小分子RNA,长度在22-24nt左右,可以降解基因的转录本或影响蛋白的翻译和表达,在转录后水平负调控基因的表达。近年来发现Wnt/β-catenin信号通路在脂肪细胞的分化中扮演分子开关(switch)的作用,即脂肪细胞的分化必然伴随着WNT信号通路的抑制;相反,WNT信号通路的激活也伴随着脂肪细胞的分化的抑制。鉴于在脂肪分化的分子机制研究中同时涉及Wnt信号通路以及miRNA的研究非常少,本文利用小鼠脂肪细胞结合脂肪分化和沉积相关的WNT信号通路,旨在阐明miRNA是如何调控WNT信号通路从而影响脂肪细胞的分化机理。
本研究首先建立了关于脂肪细胞分化的两种模型,一种是正常分化的细胞模型,即用MDI激素诱导3T3-L1小鼠前体脂肪细胞使其分化为成熟脂肪细胞,该细胞模型伴随着WNT途径受到抑制;另一种是抑制分化模型,即先用LiCl处理3T3-L1小鼠前体脂肪细胞,进而用MDI激素诱导发现细胞分化受到抑制,即LiCl处理的前体脂肪细胞无法分化为成熟脂肪细胞,该细胞模型伴随着WNT途径受到激活。
其次将两种细胞模型下的4种细胞(前体脂肪细胞,成熟脂肪细胞,LiCl处理的前体脂肪细胞,LiCl处理后MDI诱导的未分化的细胞)和小鼠的miRNAs芯片杂交,筛选不同分化状态下及信号通路的不同状态下表达有差异的miRNAs。通过生物信息学软件以及在线软件工具对miRNA的靶基因进行预测,找到两组功能不同的miRNAs:第一组是通过激活WNT信号通路,抑制脂肪细胞分化的miRNAs,有29个miRNA,包括miR-344,miR-27and miR-181;第二组是通过抑制WNT信号通路,促进脂肪细胞分化的miRNAs,共18个miRNA,包括miR-210,miR-148a,miR-194,miR-322等。
最后对部分miRNA的功能进行验证,结果发现miR-205,miR-210,miR-378可以通过靶向WNT通路中的基因,抑制了WNT信号通路从而促进脂肪细胞的分化;与此相反,miR-23a,miR-709,miR-27a/b通过靶向WNT信号通路的抑制因子,从而激活WNT信号通路抑制脂肪细胞的分化。
本研究首次结合miRNA和WNT信号通路对脂肪细胞分化的分子机制进行探讨,对脂肪细胞分化的不同阶段以及WNT信号通路激活与抑制的不同状态中的miRNA进行表达谱分析,同时对这些差异表达的miRNA进行靶基因预测以及靶基因互作的网络分析,并对miRNA的具体功能进行实验验证,不仅为脂肪分化的表达调控提供新的思路,也为猪肉质的改良的研究提供理论参考。