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目的:建立一种神经母细胞瘤循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells,CTCs)的分离和鉴定方法,优化并测定该方法的敏感性和特异性;初步评价该方法在神经母细胞瘤患者的临床疗效评估中的应用价值。另外通过研究神经母细胞瘤的基因共表达网络关系,识别神经母细胞瘤的相关模块及其关键调控基因,阐明这些模块在神经母细胞瘤中的相对重要性及其网络关系。检测处于该网络核心位置的UBE2C基因编码的蛋白在60例神经母细胞瘤患儿石蜡样本中的表达情况,分析其表达与神经母细胞瘤患儿的临床特征及预后的相关性,验证其是否可作为神经母细胞瘤患儿预后判断的肿瘤标志物。方法:1.实验室研究:1)通过免疫杂交和免疫荧光技术,在神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和IMR32中检测CD56、GD2以及CD45蛋白的表达情况。2)将神经母细胞瘤IMR32细胞与20例非肿瘤疾病患儿的外周血样本混匀,按混合的细胞数目分为两组,应用CD56免疫磁珠阳性分选后对细胞进行免疫荧光染色,统计捕获到的IMR32细胞(DAPI~+/GD2~+/CD45~-)数目,计算该方法分离和鉴定神经母细胞瘤细胞的敏感性。3)收集20例非肿瘤疾病患儿的外周血样本,应用CD56免疫磁珠阳性分选后对细胞进行免疫荧光染色,统计捕获到的IMR32细胞(DAPI~+/GD2~+/CD45~-)数目,计算该方法分离和鉴定神经母细胞瘤细胞的特异性。2.临床研究:应用上述已建立的方法检测12例神经母细胞瘤患儿的CTCs数目,所有患儿均系2015年10月至2016年3月期间在新华医院小儿血液肿瘤科诊治的初发Ⅲ期和Ⅳ期患者;同步进行血清神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、24h尿香草扁桃酸(vanilmandelic acid,VMA)、微小残留病(Minimal Residual Disease,MRD)检测和影像学检查;在化疗2疗程结束后,重复上述检测项目。3.数据分析:从基因表达谱数据库(gene expression omnibus,GEO)下载芯片数据GSE16476,其中包括88例I-IVs期神经母细胞瘤样本用以进行后续生物信息学分析。使用R语言Affy包对芯片进行重新注释后,用limma包筛选不同分期特异表达的基因。进一步使用权重基因共表达网络分析算法构建分期特异基因的权重基因共表达网络,并通过基因本体论(Gene Ontology,GO)注释富集分析研究基因表达网络的功能。4.免疫组织化学法:收集我院60例神经母细胞瘤患儿术后石蜡包埋的组织样本,通过免疫组织化学方法检测其蛋白的表达水平。回顾性分析神经母细胞瘤患儿的临床特征,采用Kaplan-Meier法分析其生存曲线,同时应用Log-rank检验、χ~2检验和Cox回归分析法探讨蛋白表达水平与患儿各临床特征参数及预后的相关性。结果:1)神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y和IMR32中均检测到CD56、GD2蛋白的表达,但未检测到CD45蛋白的表达。10个以内IMR32细胞组,CTCs捕获的敏感性为79.92±6.73%;10-100个IMR32细胞组,CTCs捕获的敏感性为79.14±3.97%。在20例非肿瘤疾病患儿的外周血中均未检测到DAPI~+/GD2~+/CD45~-细胞的存在,说明该方法捕获CTCs的特异性为100%。2)12例Ⅲ期和Ⅳ期神经母细胞瘤患儿,在治疗前有9例检测出CTCs,阳性率为75%;在化疗2疗程后的首次疗效评估时,9例患儿CTCs的数目均有不同程度减少,该动态变化趋势与患儿血清NSE水平、24h尿VMA水平、MRD变化相吻合。而影像学评估结果显示PR 3例,MR6例,NR 3例,CTCs数目比影像学能更灵敏地反映治疗效果。3)生物信息分析结果显示I期、II期和III期神经母细胞瘤组织的表达谱较为稳定,而IV期肿瘤组织存在大量差异表达基因。权重基因共表达网络分析后,发现一个与IV期神经母细胞瘤密切相关的由18个核心基因组成的基因表达调控网络,该基因网络可能参与了细胞周期的调控。本课题选取其中的关键调控基因UBE2C为研究对象,并进行深入的临床研究。4)60例患儿中,男女比例为1.73:1,中位诊断年龄为36个月(1～156个月),中位随访时间为30.7个月(3.87～47.9个月)。免疫组化结果显示,III、IV期患儿UBE2C蛋白表达的阳性率(89.7%)明显高于I、II、IVs期患儿(51.6%)(p=0.001);组织分化程度差型的神经母细胞瘤患儿UBE2C表达阳性率(82.9%)明显高于分化好型(52.0%)(p=0.021)。生存曲线分析显示,UBE2C蛋白阳性表达组预后较差(p=0.005),其中UBE2C表达阳性组和UBE2C表达阴性组2年整体生存率分别为64.3%和100%。同时Cox单因素和多因素分析均显示UBE2C蛋白表达是影响神经母细胞瘤患儿预后的独立因素(p<0.001)。结论:1)免疫磁珠阳性分选结合免疫荧光染色的方法对于神经母细胞瘤CTCs的捕获具有良好的敏感性和特异性。2)CTCs数量的变化可以很好地反映肿瘤的治疗效果,较传统的影像学方法能更及时地进行疗效评估。3)本研究所发现的以UBE2C基因为核心的表达调控网络为Ⅳ期神经母细胞瘤转移和进展机制的研究提供了新的思路。4)UBE2C的表达与神经母细胞瘤的分期及组织分化程度密切相关,UBE2C表达阳性提示神经母细胞瘤患儿预后不良。UBE2C可能在神经母细胞瘤侵袭和转移过程中发挥重要的作用,有成为神经母细胞瘤潜在的生物标志物和治疗新靶点的可能。