目的流行病学研究显示：宫颈癌发病与HPV感染有关，但HPV感染并非宫颈癌发生的唯一因素。叶酸缺乏可增加宫颈癌的发生风险。叶酸作为一碳单位的载体，参与DNA的甲基化。近年来，已发现DNA甲基化与人类多种肿瘤的发生有关，DNMT1（DNA甲基转移酶1）作为甲基化的关键酶在肿瘤的发生过程中起重要作用。研究发现宫颈癌细胞中DNMT1存在异常高表达，抑制DNMT1可逆转宫颈癌的恶性表型。那么叶酸是否通过对DNA甲基化的影响而在宫颈癌的发展过程中起作用，以及这一过程是否与HPV有关，目前相关研究甚少。在本课题组前期人群研究发现叶酸缺乏、DNMT1表达异常和宫颈癌的发生有关的基础上，本次以HPV阴性C33A和HPV16阳性Caski细胞作为研究对象，通过叶酸干预、RNA干扰的方法验证叶酸、DNMT1对宫颈癌细胞生长的影响以及与HPV16的关系，分析叶酸、DNMT1在宫颈癌变发生中的相互作用。方法运用瞬时转染技术将重组质粒和空质粒导入宫颈癌细胞C33A和Caski中，设立未转染组作为对照，在干扰与不干扰情况下，添加不同浓度叶酸，以MTT法检测宫颈癌细胞的活性，流式细胞仪分析细胞的增殖及凋亡情况，采用RT-PCR检测DNMT1、HPV16癌基因E6、E7 mRNA的表达情况，western blotting检测DNMT1蛋白表达情况。结果1、重组质粒的鉴定：重组质粒和空质粒经酶切鉴定后，获得291bp和290bp两条重组片段。重组质粒和空质粒成功转染宫颈癌细胞C33A和Caski，获得65%和63%的转染率以及53%和52%的DNMT1基因抑制率。2、叶酸对宫颈癌细胞生长的影响：（1）叶酸对宫颈癌细胞C33A和Caski的活性具有抑制作用，除了10.0μg/ml叶酸浓度组与对照组比较差别无统计学意义，两种细胞其他各组与对照组比较，均随着叶酸浓度增高，抑制作用增强(P<0.05)。同一叶酸浓度下，叶酸对Caski细胞活性的抑制作用强于C33A细胞(P<0.05)；（2）叶酸抑制宫颈癌细胞的增殖，除了10.0μg/ml叶酸浓度组与对照组比较差别无统计学意义，两种细胞其他各组与对照组比较，均随着叶酸浓度的增高，增殖抑制作用增强(P<0.05)；（3）叶酸促进宫颈癌细胞的凋亡，随着叶酸浓度的增加，凋亡程度增加。（4）不同浓度叶酸对Caski细胞中HPV16癌基因E6的表达差别间无统计学意义。叶酸浓度为1000.0μg/ml时，E7癌基因的mRNA表达与对照组比较，表达降低（F=3.248,P=0.044）。3、DNMT1对宫颈癌细胞生长的影响：DNMT1干扰后，与干扰前及空质粒比较，细胞活性降低(P<0.001)，细胞增殖受到抑制(P<0.001)，细胞凋亡增加(P<0.001)。DNMT1干扰后对Caski细胞中HPV16癌基因E6 mRNA的相对表达水平与干扰前及空质粒比较，差别无统计学意义；DNMT1干扰后对HPV16 E7癌基因mRNA与干扰前及空质粒比较，表达均降低（F=9.989,P=0.012）。4、叶酸对宫颈癌细胞中DNMT1表达的影响：叶酸对宫颈癌细胞中DNMT1 mRNA表达和蛋白表达均有抑制作用。C33A细胞中，叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时，DNMT1mRNA和蛋白表达水平与对照组比较，表达降低（DNMT1mRNA表达：F=34.728,P＜0.001；蛋白表达：F=28.735，P＜0.001）；Caski细胞中，当叶酸浓度为100.0、500.0、1000.0μg/ml时，与对照组比较，mRNA表达水平降低，叶酸浓度为250.0、500.0、1000.0μg/ml时，DNMT1蛋白表达水平与对照组比较，表达降低（DNMT1mRNA表达：F=38.242,P＜0.001；蛋白表达：F=92.807,P＜0.001）。5、叶酸、DNMT1对宫颈癌细胞生长的影响：（1）叶酸干预、DNMT1干扰后对宫颈癌细胞C33A和Caski的活性具有抑制作用，C33A细胞中，未转染组除了10.0μg /ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外，其余各组均随着叶酸浓度的升高，细胞活性受到抑制(F=184.735,P<0.001)；空质粒组在叶酸浓度为250.0、500.0、1000.0μg/ml时,与对照组比较细胞活性降低(F=482.942,P<0.001)；重组组中叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时，与对照组比较细胞活性降低(F=87.841,P<0.001)。Caski细胞中，未转染组除了10.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义，其余各组与对照组比较细胞活性均降低(F=68.185,P<0.001)；空质粒组随着叶酸浓度的升高，细胞活性受到抑制(F=210.516,P<0.001);重组组中叶酸浓度为250.0、500.0、1000.0μg/ml时，与对照组比较细胞活性降低(F=147.821,P<0.001)。同一叶酸浓度下，两种细胞中重组组与未转染组及空质粒组比较，细胞活性受到抑制。在未转染组，空质粒组以及重组组中Caski细胞活性低于C33A。（2）叶酸干预、DNMT1干扰后对宫颈癌细胞C33A和Caski的增殖具有抑制作用，C33A细胞中，未转染组中除了10.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外，其余各组与对照组比较，增值指数均降低(F=21.499,P<0.001)。空质粒组除了10.0、100.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外，其余各组与对照组比较，增殖指数下降(F=5.134,P=0.010)；重组组在叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时，细胞增殖指数与对照组比较，增殖指数降低(F=12.139,P<0.001)。Caski细胞中，未转染组、空质粒组除了10.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外，其余各组均随着叶酸浓度的升高，增殖指数降低(P<0.001)；重组组中叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时，细胞增殖指数与对照组比较降低(F=12.607,P<0.001)。同一叶酸浓度下，两种细胞中重组组与未转染组及空质粒组比较均有统计学差异，重组组的细胞增殖指数降低。（3）叶酸干预、DNMT1干扰后促进宫颈癌细胞C33A和Caski的凋亡，两种细胞中，随着叶酸浓度的升高，未转染组、空质粒组以及重组组均与各自组内的对照组比较，细胞凋亡率上升。同一叶酸浓度下，重组组与未转染组及空质粒组比较均有统计学差异，重组组的凋亡率高于后两者。（4）叶酸干预、DNMT1干扰后重组组中E6mRNA表达与对照组比较，差别无统计学意义；三个处理组中E7mRNA的表达水平均随着叶酸浓度的增加，表达降低。结论1、叶酸抑制宫颈癌细胞的生长，对两种宫颈癌细胞抑制作用的差异与HPV16感染有关。提示叶酸缺乏致宫颈癌变的过程中与HPV感染有协同作用。2﹑DNMT1干扰后抑制宫颈癌细胞的生长，并且对宫颈癌细胞抑制作用的差异与HPV16感染有关，提示DNMT1促进宫颈癌细胞的生长，且与HPV16感染有协同作用。3、叶酸抑制宫颈癌细胞中DNMT1的表达，补充叶酸可以使DNMT1表达降低。4、叶酸干预、DNMT1干扰后对宫颈癌细胞生长的抑制作用具有协同效应，对两种宫颈癌细胞抑制的差异与HPV16感染有关，提示叶酸缺乏、DNMT1表达紊乱对宫颈癌的发生具有协同作用。