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目的流行病学研究显示:宫颈癌发病与HPV感染有关,但HPV感染并非宫颈癌发生的唯一因素。叶酸缺乏可增加宫颈癌的发生风险。叶酸作为一碳单位的载体,参与DNA的甲基化。近年来,已发现DNA甲基化与人类多种肿瘤的发生有关,DNMT1(DNA甲基转移酶1)作为甲基化的关键酶在肿瘤的发生过程中起重要作用。研究发现宫颈癌细胞中DNMT1存在异常高表达,抑制DNMT1可逆转宫颈癌的恶性表型。那么叶酸是否通过对DNA甲基化的影响而在宫颈癌的发展过程中起作用,以及这一过程是否与HPV有关,目前相关研究甚少。在本课题组前期人群研究发现叶酸缺乏、DNMT1表达异常和宫颈癌的发生有关的基础上,本次以HPV阴性C33A和HPV16阳性Caski细胞作为研究对象,通过叶酸干预、RNA干扰的方法验证叶酸、DNMT1对宫颈癌细胞生长的影响以及与HPV16的关系,分析叶酸、DNMT1在宫颈癌变发生中的相互作用。方法运用瞬时转染技术将重组质粒和空质粒导入宫颈癌细胞C33A和Caski中,设立未转染组作为对照,在干扰与不干扰情况下,添加不同浓度叶酸,以MTT法检测宫颈癌细胞的活性,流式细胞仪分析细胞的增殖及凋亡情况,采用RT-PCR检测DNMT1、HPV16癌基因E6、E7 mRNA的表达情况,western blotting检测DNMT1蛋白表达情况。结果1、重组质粒的鉴定:重组质粒和空质粒经酶切鉴定后,获得291bp和290bp两条重组片段。重组质粒和空质粒成功转染宫颈癌细胞C33A和Caski,获得65%和63%的转染率以及53%和52%的DNMT1基因抑制率。2、叶酸对宫颈癌细胞生长的影响:(1)叶酸对宫颈癌细胞C33A和Caski的活性具有抑制作用,除了10.0μg/ml叶酸浓度组与对照组比较差别无统计学意义,两种细胞其他各组与对照组比较,均随着叶酸浓度增高,抑制作用增强(P<0.05)。同一叶酸浓度下,叶酸对Caski细胞活性的抑制作用强于C33A细胞(P<0.05);(2)叶酸抑制宫颈癌细胞的增殖,除了10.0μg/ml叶酸浓度组与对照组比较差别无统计学意义,两种细胞其他各组与对照组比较,均随着叶酸浓度的增高,增殖抑制作用增强(P<0.05);(3)叶酸促进宫颈癌细胞的凋亡,随着叶酸浓度的增加,凋亡程度增加。(4)不同浓度叶酸对Caski细胞中HPV16癌基因E6的表达差别间无统计学意义。叶酸浓度为1000.0μg/ml时,E7癌基因的mRNA表达与对照组比较,表达降低(F=3.248,P=0.044)。3、DNMT1对宫颈癌细胞生长的影响:DNMT1干扰后,与干扰前及空质粒比较,细胞活性降低(P<0.001),细胞增殖受到抑制(P<0.001),细胞凋亡增加(P<0.001)。DNMT1干扰后对Caski细胞中HPV16癌基因E6 mRNA的相对表达水平与干扰前及空质粒比较,差别无统计学意义;DNMT1干扰后对HPV16 E7癌基因mRNA与干扰前及空质粒比较,表达均降低(F=9.989,P=0.012)。4、叶酸对宫颈癌细胞中DNMT1表达的影响:叶酸对宫颈癌细胞中DNMT1 mRNA表达和蛋白表达均有抑制作用。C33A细胞中,叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时,DNMT1mRNA和蛋白表达水平与对照组比较,表达降低(DNMT1mRNA表达:F=34.728,P<0.001;蛋白表达:F=28.735,P<0.001);Caski细胞中,当叶酸浓度为100.0、500.0、1000.0μg/ml时,与对照组比较,mRNA表达水平降低,叶酸浓度为250.0、500.0、1000.0μg/ml时,DNMT1蛋白表达水平与对照组比较,表达降低(DNMT1mRNA表达:F=38.242,P<0.001;蛋白表达:F=92.807,P<0.001)。5、叶酸、DNMT1对宫颈癌细胞生长的影响:(1)叶酸干预、DNMT1干扰后对宫颈癌细胞C33A和Caski的活性具有抑制作用,C33A细胞中,未转染组除了10.0μg /ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外,其余各组均随着叶酸浓度的升高,细胞活性受到抑制(F=184.735,P<0.001);空质粒组在叶酸浓度为250.0、500.0、1000.0μg/ml时,与对照组比较细胞活性降低(F=482.942,P<0.001);重组组中叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时,与对照组比较细胞活性降低(F=87.841,P<0.001)。Caski细胞中,未转染组除了10.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义,其余各组与对照组比较细胞活性均降低(F=68.185,P<0.001);空质粒组随着叶酸浓度的升高,细胞活性受到抑制(F=210.516,P<0.001);重组组中叶酸浓度为250.0、500.0、1000.0μg/ml时,与对照组比较细胞活性降低(F=147.821,P<0.001)。同一叶酸浓度下,两种细胞中重组组与未转染组及空质粒组比较,细胞活性受到抑制。在未转染组,空质粒组以及重组组中Caski细胞活性低于C33A。(2)叶酸干预、DNMT1干扰后对宫颈癌细胞C33A和Caski的增殖具有抑制作用,C33A细胞中,未转染组中除了10.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外,其余各组与对照组比较,增值指数均降低(F=21.499,P<0.001)。空质粒组除了10.0、100.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外,其余各组与对照组比较,增殖指数下降(F=5.134,P=0.010);重组组在叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时,细胞增殖指数与对照组比较,增殖指数降低(F=12.139,P<0.001)。Caski细胞中,未转染组、空质粒组除了10.0μg/ml浓度组与对照组比较差别无统计学意义外,其余各组均随着叶酸浓度的升高,增殖指数降低(P<0.001);重组组中叶酸浓度为500.0、1000.0μg/ml时,细胞增殖指数与对照组比较降低(F=12.607,P<0.001)。同一叶酸浓度下,两种细胞中重组组与未转染组及空质粒组比较均有统计学差异,重组组的细胞增殖指数降低。(3)叶酸干预、DNMT1干扰后促进宫颈癌细胞C33A和Caski的凋亡,两种细胞中,随着叶酸浓度的升高,未转染组、空质粒组以及重组组均与各自组内的对照组比较,细胞凋亡率上升。同一叶酸浓度下,重组组与未转染组及空质粒组比较均有统计学差异,重组组的凋亡率高于后两者。(4)叶酸干预、DNMT1干扰后重组组中E6mRNA表达与对照组比较,差别无统计学意义;三个处理组中E7mRNA的表达水平均随着叶酸浓度的增加,表达降低。结论1、叶酸抑制宫颈癌细胞的生长,对两种宫颈癌细胞抑制作用的差异与HPV16感染有关。提示叶酸缺乏致宫颈癌变的过程中与HPV感染有协同作用。2﹑DNMT1干扰后抑制宫颈癌细胞的生长,并且对宫颈癌细胞抑制作用的差异与HPV16感染有关,提示DNMT1促进宫颈癌细胞的生长,且与HPV16感染有协同作用。3、叶酸抑制宫颈癌细胞中DNMT1的表达,补充叶酸可以使DNMT1表达降低。4、叶酸干预、DNMT1干扰后对宫颈癌细胞生长的抑制作用具有协同效应,对两种宫颈癌细胞抑制的差异与HPV16感染有关,提示叶酸缺乏、DNMT1表达紊乱对宫颈癌的发生具有协同作用。