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目的:研究脑缺血再灌注损伤对TIGAR蛋白的调节及相应的分子机制。方法:采用小鼠短暂性大脑中动脉阻塞再灌注(transient middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R)模型和体外培养原代神经元缺糖缺氧再复糖复氧(oxygen glucose dripivation/reoxygenation,OGD/R)模型。使用Western blot法检测缺血后小鼠大脑皮层和原代皮层神经元中TIGAR和p53蛋白的表达;在缺血前0.5 h给予p53抑制剂pifithrin-alpha(PFT-α,30μM),Western blot法检测PFT-α对原代皮层神经元中TIGAR以及p53靶蛋白Bax表达的影响;构建p53慢病毒感染原代皮层神经元细胞敲除p53蛋白,检测细胞内TIGAR、p53、Bax蛋白的水平。使用强生血糖仪检测小鼠缺血前后的血糖水平,Western blo法检测胰岛素(insulin,1 U/kg)对小鼠缺血皮层区TIGAR表达的影响。小鼠尾静脉注射50%的葡萄糖溶液(500 g/kg),检测血糖水平和大脑皮层区TIGAR的表达。采用不同浓度的葡萄糖溶液(0-150μM)刺激HT22细胞2 h,Western blot法检测细胞内TIGAR的水平,CCK8检测细胞的活性以及在荧光显微镜下观察HT22细胞的形态。小鼠侧脑室注射肾上腺素(0.12mg/kg)、尾静脉注射氢化可的松(50,100,200,400 mg/kg)以及胰高血糖素(0.1,0.5,1,5,10 mg/kg),Western-blot法检测大脑皮层区TIGAR的水平;采用不同浓度的肾上腺素(0.1,1,10,50μM)、氢化可的松(0.01,0.1,1,10,100μM)、胰高血糖素(0.001,0.01,0.1,1,10μM)以及胰岛素(0.0625,0.125,0.25,0.5,1μM)刺激HT22细胞3 h,检测细胞内TIGAR的水平。体外培养原代皮层神经元细胞,采用过氧化氢(H2O2,10,30,90μM)共同培养(3,6,12 h)造氧化应激模型,CCK8检测细胞存活率,GSH/GSSG试剂盒检测细胞内的GSH水平,DHE探针标记检测细胞内ROS变化以及Western-blot法检测细胞内TIGAR的水平。提前4 h给予抗氧化剂NADPH(10μM),检测细胞内TIGAR和ROS的水平。使用Western blot法检测缺血后小鼠大脑皮层和原代皮层神经元中SP1蛋白的表达;在缺血前24 h给予SP1抑制剂MIT(mithramycin A,300 n M),Western blot法检测MIT对原代皮层神经元中TIGAR表达的影响;构建SP1慢病毒感染原代皮层神经元敲除SP1蛋白,检测细胞内TIGAR和SP1的蛋白水平。结果:小鼠脑缺血再灌注后,TIGAR水平明显升高,在3 h达到峰值(P<0.001)。原代皮层神经元在OGD/R后,TIGAR和p53蛋白水平明显升高,分别在3 h和6 h达到峰值(P<0.01,P<0.001)。Western blot结果显示:使用p53抑制剂PFT-α后对缺血再灌注诱导的TIGAR的上升没有影响,但是能够明显抑制p53靶蛋白Bax的水平(P<0.001)。构建的p53慢病毒能够显著抑制原代皮层神经元细胞中p53和Bax的蛋白水平,而对TIGAR的表达没有明显影响。小鼠脑缺血再灌注后,血糖水平明显上升,在0.5 h达到峰值(P<0.001),使用胰岛素控制血糖水平后(P<0.001),TIGAR的诱导表达被部分抑制了(P<0.01)。给小鼠尾静脉注射50%的葡萄糖溶液,血糖水平明显上升,但是TIGAR的水平没有明显变化。体外培养海马神经元细胞系HT22细胞,加入葡萄糖继续培养2 h,对TIGAR的表达、细胞活力以及形态均未造成明显影响。HT22细胞在无糖预培养4 h后加入葡萄糖继续培养2 h,Western blot结果显示TIGAR的水平没有变化。在体内实验中,Western blot结果显示:肾上腺素能够明显诱导TIGAR蛋白(P<0.001,P<0.001,P<0.001);3 h时氢化可的松能诱导TIGAR蛋白表达,且呈现剂量依赖性,50 mg/kg的氢化可的松在给药后1 h和2 h时明显激活TIGAR表达(P<0.01,P<0.01);0.5和1 mg/kg的胰高血糖素在给药后2 h时能够诱导TIGAR的表达(P<0.05,P<0.05)。体外实验中,HT22细胞加入激素后继续培养3 h,Western blot结果显示:1μM的肾上腺素、0.1μM的氢化可的松和1μM的胰高血糖素能够增加TIGAR的表达(P<0.01,P<0.001,P<0.01),同时,低剂量的胰岛素在一定低浓度范围内抑制TIGAR蛋白的表达而高剂量的胰岛素能激活TIGAR(P<0.01,P<0.001)。培养原代皮层神经元细胞,加入H2O2继续培养造氧化应激模型,CCK-8、GSH、DHE和Western blot结果显示:30和90μM的H2O2有效抑制了神经元细胞的活力(P<0.001,P<0.001),降低了细胞内的GSH水平(P<0.05,P<0.001),增加了细胞内的ROS水平(P<0.01,P<0.01),同时在3 h时H2O2能够明显激活TIGAR的表达,且呈现剂量依赖性。提前4 h加入抗氧化剂NADPH,Western blot和DHE结果显示:NADPH能够部分抑制TIGAR的上调以及ROS的增加(P<0.001,P<0.05)。Western blot结果显示:脑缺血再灌注后,小鼠大脑皮层区和原代皮层神经元细胞中SP1蛋白明显被激活,分别在0.5 h和1 h达到峰值(P<0.001,P<0.001),使用SP1抑制剂MIT后能够明显抑制缺血再灌注诱导的TIGAR的上升(P<0.001),构建的SP1慢病毒能够明显抑制原代皮层神经元细胞中SP1蛋白的表达(P<0.001),同时能够明显抑制缺血再灌注诱导的TIGAR的上升(P<0.001)。结论:脑缺血再灌注激活TIGAR和p53,并且TIGAR的变化不依赖于p53蛋白。脑缺血再灌注诱导血糖上升,控制血糖水平能够部分抑制TIGAR的表达;葡萄糖不能直接调控TIGAR;升血糖激素(肾上腺素、氢化可的松、胰高血糖素)能够诱导TIGAR,而降血糖激素胰岛素在一定剂量范围内抑制TIGAR的表达。ROS能够诱导TIGAR的表达,抑制ROS则抑制TIGAR的水平。脑缺血再灌注诱导SP1的表达,体外实验证实,TIGAR受SP1的调节。