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随着人们对精准医疗的迫切需求和对功能基因组的深入研究,基因检测和治疗被寄予了很高的期望,科学家们希望能从基因角度为人类多个领域的复杂疾病带来持久改善和治疗。非编码小RNA中miRNA和siRNA的发现给基因检测和治疗增添了具有潜力的靶标和治疗工具。然而,由于其自身不稳定和生理环境的干扰阻碍了它们的临床应用。目前,开发具有可行性的探针和载体致力于非编码小RNA在基因检测和治疗中的应用,是一种非常有前景的解决方法。本论文主要围绕miRNA和siRNA致力于功能化探针和载体的开发和应用研究,其中包括三种基于张力介导的高特异性识别探针的制备及其用于miRNA的检测研究和响应性共价交联纳米载体的制备及其用于siRNA的运输研究。
①闭合环形探针用于细胞内miRNA检测与成像研究
采用高效的无铜点击化学方法连接制备了具有较大张力的闭合环形探针。将环形探针和线性探针进行对比分析,结果表明正是由于环状结构触发的较大张力,促使探针具有高特异性识别能力,且在没有任何酶辅助和室温的条件下即可区分单碱基错配序列。更重要的是,将环形探针转入不同细胞系活细胞中,其信号强度与细胞中miRNA表达水平一致,表明环形探针可应用于活细胞中的内源性miRNA检测和成像。该研究利用环张力来提高探针的特异性识别能力,为miRNA检测和细胞内成像提供了一种新的思路。
②双重信号放大的环形探针用于miRNA高灵敏度定量检测
设计制备了一种具有高灵敏度和高选择性的miRNA检测探针,该探针通过集成闭合环形探针和两种信号放大系统(自催化DNAzyme和具有光捕获能力的阳离子共轭聚合物)制备而成。正是由于靶标miRNA激活了DNAzyme的自催化循环裂解以及共轭聚合物与小分子染料之间的荧光共振能量转移(FRET)进而引发了高信号扩增效率,使探针的灵敏度得到有效提高,可灵敏地检测出低至1.5fM的let-7a。此外,基于环张力和粘性末端介导的链置换作用使探针具有高选择性,可以轻松地区分miRNA家族成员之间的单碱基错配差异。更重要的是,该探针可用于定量检测三种细胞系中let-7a的含量,其结果与qRT-PCR一致。因此,该双重信号放大的探针在高选择性和敏感的miRNA检测分析中具有重要意义,可成为miRNA相关疾病早期诊断的潜在候选者。
③基于逻辑门和双重信号放大的探针用于miRNA多元灵敏检测
设计并制备了灵敏的多元miRNA检测探针,该探针延续了双重信号扩增的环形探针的高特异性和高灵敏度。在Y形DNA和链霉亲和素磁珠的引入下,通过共轭聚合物与不同染料标记的底物链之间高效的荧光共振能量转移(FRET),实现单次荧光激发的条件下多种信号同时输出。此外,通过观察以miRNA为输入的相应标记染料的发射强度来操作不同类型的逻辑门,大大简化了数据的复杂性,从而为以逻辑信号为基础特异性检测多元miRNAs提供了新的途径。更重要的是,我们成功地将探针应用于细胞裂解物中的多种miRNAs检测,结果与qRT-PCR吻合。因此,我们相信该平台具有在生物样品中同时检测多元miRNAs的巨大潜力。
④pH响应的siRNA共价交联纳米颗粒用于小鼠急性肝损伤的治疗研究
该研究提出了一种新的siRNA运输载体(PNSDS),是一种无电荷的纳米载体,主要由多臂聚乙二醇(PEG)为骨架、带有酸敏感基团和叠氮基团的疏水链以及环辛炔修饰的siRNA和甘露糖,采用共价交联的方式制备而成。正是由于PNSDS独特的siRNA交联结构使其具有最小的细胞毒性、高的siRNA负载率以及刺激响应等特性,使载体能在细胞内特定pH条件下选择性地释放siRNA。结果表明PNSDS可以将肿瘤坏死因子α(TNF-α)siRNA运输进入巨噬细胞中,有效地诱导靶基因下调。此外,具有甘露糖靶向配体修饰的M-PNSDS可以选择性地在小鼠肝脏中累积,特异性地抑制体内TNF-α的表达,从而保护小鼠免受炎症引起的肝损害。因此,这项工作为模块化和功能化siRNA载体系统提供了新的途径,有效的提高基于RNAi疗法的治疗潜力。
①闭合环形探针用于细胞内miRNA检测与成像研究
采用高效的无铜点击化学方法连接制备了具有较大张力的闭合环形探针。将环形探针和线性探针进行对比分析,结果表明正是由于环状结构触发的较大张力,促使探针具有高特异性识别能力,且在没有任何酶辅助和室温的条件下即可区分单碱基错配序列。更重要的是,将环形探针转入不同细胞系活细胞中,其信号强度与细胞中miRNA表达水平一致,表明环形探针可应用于活细胞中的内源性miRNA检测和成像。该研究利用环张力来提高探针的特异性识别能力,为miRNA检测和细胞内成像提供了一种新的思路。
②双重信号放大的环形探针用于miRNA高灵敏度定量检测
设计制备了一种具有高灵敏度和高选择性的miRNA检测探针,该探针通过集成闭合环形探针和两种信号放大系统(自催化DNAzyme和具有光捕获能力的阳离子共轭聚合物)制备而成。正是由于靶标miRNA激活了DNAzyme的自催化循环裂解以及共轭聚合物与小分子染料之间的荧光共振能量转移(FRET)进而引发了高信号扩增效率,使探针的灵敏度得到有效提高,可灵敏地检测出低至1.5fM的let-7a。此外,基于环张力和粘性末端介导的链置换作用使探针具有高选择性,可以轻松地区分miRNA家族成员之间的单碱基错配差异。更重要的是,该探针可用于定量检测三种细胞系中let-7a的含量,其结果与qRT-PCR一致。因此,该双重信号放大的探针在高选择性和敏感的miRNA检测分析中具有重要意义,可成为miRNA相关疾病早期诊断的潜在候选者。
③基于逻辑门和双重信号放大的探针用于miRNA多元灵敏检测
设计并制备了灵敏的多元miRNA检测探针,该探针延续了双重信号扩增的环形探针的高特异性和高灵敏度。在Y形DNA和链霉亲和素磁珠的引入下,通过共轭聚合物与不同染料标记的底物链之间高效的荧光共振能量转移(FRET),实现单次荧光激发的条件下多种信号同时输出。此外,通过观察以miRNA为输入的相应标记染料的发射强度来操作不同类型的逻辑门,大大简化了数据的复杂性,从而为以逻辑信号为基础特异性检测多元miRNAs提供了新的途径。更重要的是,我们成功地将探针应用于细胞裂解物中的多种miRNAs检测,结果与qRT-PCR吻合。因此,我们相信该平台具有在生物样品中同时检测多元miRNAs的巨大潜力。
④pH响应的siRNA共价交联纳米颗粒用于小鼠急性肝损伤的治疗研究
该研究提出了一种新的siRNA运输载体(PNSDS),是一种无电荷的纳米载体,主要由多臂聚乙二醇(PEG)为骨架、带有酸敏感基团和叠氮基团的疏水链以及环辛炔修饰的siRNA和甘露糖,采用共价交联的方式制备而成。正是由于PNSDS独特的siRNA交联结构使其具有最小的细胞毒性、高的siRNA负载率以及刺激响应等特性,使载体能在细胞内特定pH条件下选择性地释放siRNA。结果表明PNSDS可以将肿瘤坏死因子α(TNF-α)siRNA运输进入巨噬细胞中,有效地诱导靶基因下调。此外,具有甘露糖靶向配体修饰的M-PNSDS可以选择性地在小鼠肝脏中累积,特异性地抑制体内TNF-α的表达,从而保护小鼠免受炎症引起的肝损害。因此,这项工作为模块化和功能化siRNA载体系统提供了新的途径,有效的提高基于RNAi疗法的治疗潜力。