背景和目的:糖尿病肾病是糖尿病主要并发症之一,最为常见并且最为严重。糖尿病肾病已经成为慢性肾病,以及终末期肾病的主要发病原因。在世界范围内和中国,糖尿病及糖尿病肾病的发病率都在逐渐上升,是一项极大的社会负担。目前针对糖尿病肾病的主要治疗措施是严格控制血糖,以及辅助控制血压,改善生活方式等。严格控制血糖虽然能部分延缓白蛋白尿的发生,但是在长时间的观察随访中,并不能阻止或改善糖尿病肾病的发生发展,在多年后肾小球滤过率依然大幅降低,甚至增加全因或者心血管原因的死亡率。使用胰岛素在1型或者2型糖尿病患者进行血糖控制,甚至增加低血糖事件发生的风险。因此,探索血糖控制或胰岛素方案之外的糖尿病肾病治疗措施十分必要。有报道发现食辣人群相比于不食辣人群在肾脏疾病发生和进展上有不同程度的减缓作用,但是尚无相关机制的研究。辣椒素通过激活体内一种瞬时受体电位(Transient receptor potential,TRP)通道TRPV1发挥作用。TRP通道是一类可以透过多种阳离子,包括Ca2+,Mg2+等的非选择性阳离子通道,参与调节与Ca2+相关的多种细胞行为。而肾脏中存在TRPs通道的表达,参与肾脏功能的调控。TRPV1可以被包括辣椒素在内的多种内源性和外源性因素激活,膳食辣椒素激活TRPV1后,增加细胞内的瞬时Ca2+内流,参与调控多种组织的生理功能。有报道TRPV1参与调控急性肾损伤,但是其对糖尿病肾病的影响尚未有研究。有报道TRPV1在脂肪等组织中,可以激活AMPK。但是TRPV1在肾脏中是否能激活AMPK及其相关可能通路尚无报道。另外,近年来人们也关注到另外一种治疗方法,代谢手术,对糖尿病肾病的治疗效果。代谢手术最初应用于肥胖的治疗,现在已经广泛应用于2型糖尿病的治疗。在世界范围内以及中国,近年来施行的代谢手术的主要目的已经从肥胖变为代谢相关疾病,包括糖尿病,施行的最主要术式也变为Roux-en-Y胃旁路术(Roux-en-Y Gastric Bypass)。关于代谢手术对于糖尿病肾病的改善效应已经在部分回顾性研究中得到证实。在部分伴有糖尿病肾病的患者进行手术后,糖尿病肾病得到显著改善,尿蛋白降低,肾小球滤过率恢复。而且在手术前肾功能已经严重损伤的患者,手术也具有显著的效果,而且十分安全。但是手术改善糖尿病肾病的机制尚无报道。在糖尿病肾病的发生与发展中,足细胞线粒体功能障碍是十分重要的一环。在糖尿病状态下,足细胞的线粒体功能严重缺陷,能量生成不足。而线粒体的Ca2+稳态是线粒体功能维持的基础。线粒体发生Ca2+超载会导致线粒体功能的严重损伤。线粒体相关内质网膜(Mitochondria-associated ER membrane,MAM)是线粒体与内质网之间的连接通道,允许Ca2+从内质网进入线粒体,对调节线粒体的Ca2+稳态十分重要。在一些糖尿病靶器官中,MAM的形成参与线粒体Ca2+稳态的调节。但是MAM在糖尿病肾病中的作用尚未得到研究。有报道AMPK在心脏中可以调控MAM的形成,但是在肾脏中,AMPK对MAM的作用,尚未有报道。AMPK在糖尿病肾病治疗中的可能作用被广泛报道。目前认为糖尿病状态下AMPK的活性被抑制。但是糖尿病状态下,线粒体功能缺陷,能量生成不足,AMPK应该被激活,但是大量研究报道AMPK活性被抑制,这其中的机制鲜有研究。探索AMPK活性被抑制的机制对于糖尿病以及糖尿病肾病的治疗都具有重大意义。本文的目的在于:1,辣椒素改善糖尿病肾病的机制。2,AMPK与MAM在辣椒素改善糖尿病肾病改善中的作用。3,代谢手术改善糖尿病肾病的机制。4,研究AMPK在糖尿病状态下未激活的机制。材料方法:本研究由两部分组成,第一部分,在db/db小鼠以及TRPV1敲除小鼠,探索TRPV1对糖尿病肾病的作用,以及AMPK和MAM在其中的作用机制。第二部分,在糖尿病大鼠和AMPKα2敲除小鼠中,进行RYGB手术干预,探索AMPK在糖尿病状态被抑制以及RYGB手术改善糖尿病肾病的机制。具体内容如下:1.在db/db小鼠和TRPV1 KO糖尿病小鼠以及对照小鼠中,以膳食辣椒素干预16周,观察肾脏功能指标,尿白蛋白,肾小球滤过率,血肌酐,尿素氮。观察肾脏病理结构。2.检测WT和TRPV1 KO糖尿病小鼠的线粒体功能,数量的变化。检测线粒体和内质网的Ca2+稳态,在电镜中观察足细胞中MAM的形成。3.检测辣椒素干预后,对糖尿病小鼠肾小球和足细胞AMPK,nephrin,podocin,CaMKKβ蛋白表达变化的影响,进一步通过转染Ca MKKβsi RNA,以及用CaMKKβ抑制剂干预足细胞,检测辣椒素激活AMPK的机制。4.检测辣椒素干预后,小鼠肾小球和足细胞Fundc1蛋白和MAM蛋白表达和复合体完整性。进一步在足细胞系过表达Func1,检测Fundc1蛋白对MAM蛋白表达和复合体完整性的影响。5.检测AMPK对Fundc1蛋白表达,Fundc1蛋白启动子区域与ZF5蛋白结合对Fundc1蛋白转录的影响。6.在SD大鼠以STZ诱导糖尿病,4周后对糖尿病大鼠进行RYGB手术,观察大鼠的肾脏功能指标,尿白蛋白,肾小球滤过率,血肌酐,尿素氮。观察肾脏病理结构。检测手术对大鼠线粒体功能,数量,AMPK,PGC1-α的表达的影响。7.为了检测AMPK在手术效果中的作用,分别在WT和AMPKα2敲除小鼠中,以STZ诱导糖尿病,然后进行手术干预,以及在手术后的糖尿病大鼠中,以微渗透泵给与AMPK抑制剂CC,观察肾功能指标变化。8.检测手术对大鼠肾皮质AMP/ATP的比例的影响。9.对糖尿病大鼠和手术后大鼠肾皮质进行microarray m RNA芯片检测,探索与AMPK相关的变化通路。10.检测糖尿病大鼠和手术后大鼠肾皮质NADPH含量变化,NADPH合成酶H6PD表达的变化。在细胞中验证NADPH对AMPK活性的影响。在大鼠注射H6PD的r AAV,在体验证NADPH含量对AMPK活性的影响,对肾脏功能的影响。结果:1.db/db小鼠和STZ诱导的糖尿病WT小鼠肾功能下降,膳食辣椒素干预的db/db和WT小鼠,肾功能改善,而TRPV1 KO小鼠肾功能没有改善。2.糖尿病小鼠足细胞线粒体钙超载,MAM形成显著增多,而辣椒素干预的小鼠,线粒体钙超载改善,MAM减少。3.激活TRPV1后,肾小球和足细胞系的AMPK磷酸化,nephrin和podocin的表达增加。给与CaMKKβ的siRNA或抑制剂后,AMPK磷酸化,nephrin和podocin的表达下调。4.激活TRPV1后,肾小球和足细胞系的Fundc1表达下调,Fundc1过表达后,MAM形成增多,线粒体钙超载。5.AMPK激活后显著抑制Fundc1表达以及启动子区域与ZF5蛋白的结合。6.在糖尿病大鼠,手术后可以显著改善肾功能和线粒体功能,并且肾小球AMPK磷酸化和PGC1-α表达上调。7.手术对糖尿病肾病的改善效应在AMPK抑制剂CC干预大鼠或AMPKα2基因敲除后显著减弱。8.糖尿病大鼠以及手术后大鼠肾皮质AMP/ATP比例升高。9.手术后大鼠NADPH合成酶H6PD表达下调,肾皮质NADPH含量减少。在足细胞系中,NADPH显著抑制AMPK活性。10.糖尿病大鼠在给与H6PD shRNA rAAV后,AMPK磷酸化上调,肾功能显著恢复。结论:1.辣椒素激活TRPV1可以显著改善足细胞线粒体功能及糖尿病肾病。2.辣椒素激活TRPV1,促进瞬时Ca2+内流,通过上调CaMKKβ表达激活AMPK,AMPK进一步抑制Fundc1表达从而抑制MAM的形成,改善线粒体Ca2+稳态。3.糖尿病大鼠肾皮质AMPK活性被抑制,代谢手术可改善肾小球线粒体功能及改善糖尿病肾病,其机制与代谢手术致H6PD表达下调,NADPH生成减少以及AMPK被激活有关。