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目的：研究下瘀血汤药物血清对LPS诱导活化后RAW264.7细胞表达MMPs/TIMPs的影响,探讨其抗肝纤维化的作用机制。
方法：选用终浓度为100μg/L的LPS刺激RAW264.7细胞,ELISA法分别测定0.5h,1h,2h,4h,6h,12h细胞培养上清中TNF-α含量,选择模型时间点；测定RAW264.7细胞培养上清中LDH含量,分析终浓度分别为2.5％、5％、10％和20％的正常大鼠血清和下瘀血汤药物血清的细胞毒性；Western Blot法检测RAW264.7细胞TNF-α、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2、CD14的蛋白表达；Real Time PCR法检测RAW264.7细胞TNF-α、CD68、MMP-9、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2的mRNA表达。
结果：
1.与相应浓度的小牛血清组相比,2.5％、5％、20％正常大鼠血清组细胞培养上清中LDH含量降低(p<0.01),10％正常大鼠血清组细胞培养上清LDH含量无明显变化(p>0.05);与相应浓度正常大鼠血清组相比,2.5％、5％和20％下瘀血汤药物血清组细胞培养上清中LDH含量显著升高(p<0.01),10％下瘀血汤药物血清组细胞培养上清中LDH含量无明显变化(p>0.05);显示2.5％、5％、10％和20％浓度的正常大鼠血清以及10％下瘀血汤药物血清对RAW264.7细胞的毒性作用较小。后续实验中均选用10％浓度的正常大鼠血清和下瘀血汤药物血清。
2.与相应时间点正常大鼠血清组相比较,在0.5h时间点,正常大鼠血清+LPS组细胞培养上清中TNF-α含量无明显变化(p>0.05);1h、2h、4h、6h和12h时间点,正常大鼠血清+LPS组细胞培养上清中TNF-α含量均显著升高(p<0.01)。其中1h时,上清中TNF-α含量开始增加,4h时,达到最高,6h时,开始下降。后续实验选用4h、6h两个时间点。
3.Western blot结果显示,与相应时间点正常组相比,4h、6h模型组RAW264.7细胞TNF-α、MMP-2、MMP-9、MMP-13、TIMP-1、TIMP-2和CD14的蛋白表达显著升高(p<0.01)。与相应时间点模型组相比,4h下瘀血汤药物血清组TNF-α、MMP-9、T1MP-1、TIMP-2、CD14和MMP-13蛋白表达显著降低(p<0.01),MMP-2蛋白表达显著升高(p<0.01);6h下瘀血汤药物血清组TNF-α和MMP-13蛋白表达则显著升高(p<0.01),MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2和CD14蛋白表达则明显降低(p<0.01)。
4.Real Time PCR结果显示,与相应时间点正常组相比,4h模型组RAW264.7细胞CD68、TNF-α、MMP-9、MMP-13和TIMP-1mRNA表达显著升高(p<0.01);6h模型组RAW264.7细胞TNF-α、MMP-9、MMP-13、TIMP-1和TIMP-2mRNA表达显著升高(p<0.01)。与相应时间点模型组相比,4h下瘀血汤药物血清组RAW264.7细胞TNF-α、CD68、MMP-9、MMP-13和TIMP-1mRNA表达显著降低(p<0.01);6h下瘀血汤药物血清组RAW264.7细胞TNF-αmRNA表达显著升高(p<0.01),TIMP-1、TIMP-2mRNA表达显著降低(p<0.01)。
结论：
1.LPS诱导RAW264.7细胞活化的主要机制是LPS与膜分子CD14结合,继发的TNF-α表达增加、MMPs/TIMPs表达失衡是其活化后的主要生物学改变。
2.下瘀血汤药物血清通过抑制RAW264.7细胞CD14的表达而抑制RAW264.7细胞活化,减少TNF-αmRNA和蛋白的表达,调控RAW264.7细胞MMPs/TIMs的表达。
3.下瘀血汤抑制KCs活化,调控MMPs/TIMPs的表达是其抑制肝纤维化的主要分子生物学机制。