第一部分 GelMA水凝胶生物支架的制作及其材料结构和性能表征[目的]构建定向Gelatin和GelMA水凝胶生物支架,并评估相关物理和化学性能。[方法]首先制备GelMA材料,再使用静电纺丝和紫外光照交联,制备出定向GelMA水凝胶纤维,通过纤维的多次折叠即可得到纤维束。使用静电纺丝技术制备出定向Gelatin和GelMA纤维,再通过戊二醛的交联作用,得到定向Gelatin水凝胶纤维,通过光交联获得GelMA水凝胶纤维,再通过纤维的多次折叠得到相应的纤维束支架。采用SEM对材料进行拍照,所得的图像结合NanoMesurer软件分析两组纤维的直径分布情况,采用吸水称重的方式评估支架的吸水率,将纤维支架放置在PBS中,通过称重,考察纤维支架的降解率。通过生物力学仪器测试其力学性能。[结果]经过SEM图片和NanoMesurer分析,本实验通过平行接收装置制备出表面光滑,具有相同方向的纤维支架,而滚筒接收制备的纤维支架是定向性较差。其中GelMA纤维支架的直径为1.1±0.13um,Gelatin纤维支架的直径为1.4±0.13um;通过力学测试,可以得到两种纤维支架都具有一定的弹性。其中GelMA纤维支架的最大拉伸长度是原长度的4.54倍,Gelatin纤维支架的最大拉伸长度近原长度的1.94倍。通过计算杨氏模量可以得到,GelMA纤维支架的杨氏模量为0.7Kpa,远远小于Gelatin纤维支架的杨氏模量(1.5Kpa)。而循环应力-应变结果结果显示,Gelatin纤维支架的应力应变曲线的斜率,随着反复拉伸有很大的变化。于此相反,GelMA纤维支架的曲线斜率基本不变。吸水率的测试结果显示,在0天时,GelMA纤维支架的吸水率是本身的6.17倍,而Gelatin纤维支架为5.26倍。虽然随着时间的延长,两种支架的吸水率都在下降,但是GelMA支架的吸水率始终大于Gelatin(p<0.05)。降解实验显示,在第 3 天时,GelMA 剩余 94.8±0.84%,Gelatin 剩余 95.2±0.84(p>0.05),但是随着时间的延长,Gelatin支架和GelMA支架的降解率差距在增大,35天后Gelatin支架剩余 40±1.58%,而 GelMA 支架只剩下 19±1.58%(p<0.05)。[结论]GelMA纤维支架具备定向良好的定向效果和力学性能,并且实现较好的保水性和可降解性。第二部分 GelMA水凝胶生物支架促进BMSCs和神经元细胞的粘附和体外迁移的研究[目的]探讨定向Gelatin和GelMA水凝胶生物支架促进大鼠BMSCs和海马神经元细胞迁移、黏附、增殖的能力。[方法]将BMSCs种植在Gelatin和GelMA支架上,培养1天后,将种植在支架上的细胞进行酒精脱水,冻干后利用扫描电子显微镜观察细胞的粘附和迁移。将BMSCs种植在两种支架上后在第1和3天,使用CCK-8法检测细胞增殖率。通过鬼笔环肽染色检测支架促进细胞粘附的能力。使用活死细胞染色技术,检测支架的生物相容性。通过荧光染色,观察纤维支架对海马神经元细胞的形态和轴突生长的影响。采用共聚焦显微镜和鬼笔环肽染色,在培养细胞的1、2、3天后,进行拍照,考察Gelatin和GelMA支架促进细胞迁徙渗透的能力。[结果]BMSCs在Gelatin和GelMA支架上状态正常,粘附良好,且细胞朝GelMA支架深处迁移。鬼笔环肽染色显示,BMSCs在两种支架上都有很好的粘附,但对照组上细胞形状为不规则形状,朝向不定,而长在Gelatin和GelMA支架上的细胞细长,且定向。活死细胞染色结果显示,接种在Gelatin和GelMA的细胞大部分都存活。CCK-8结果显示,在培养的1、3天细胞正常增殖。GelMA支架显著促进细胞的增殖,相对于其余二组差异有显著统计学意义(p<0.01),对海马神经元细胞的轴突染色结果显示,对照组上的海马神经元细胞没有生长,轴突没有延伸,非定向的两种纤维支架虽然可以促进轴突的延长,但是不能使轴突朝一个方向延伸。而Gelatin支架和GelMA支架上的海马神经元细胞不仅数量多,定向,而且轴突延伸性好,其中GelMA支架上的轴突延伸性最好。通过鬼笔环肽染色和共聚焦显微镜拍照,可以看出,GelMA支架上的细胞随着时间的延长,正在逐渐的往下迁移(第一天为38.9±4.92um,第二天为127.55±14.54um,第三天为197.5±18.lum),而Gelatin支架上的细胞只有轻微迁移(第一天 24±4.35um,第二天 41.87±6.28um,第三天 60.6±8.4um)。定量数据显示GelMA组与Gelatin组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。[结论]GelMA支架生物相容性良好,能促进细胞在支架上黏附、增殖、迁移;在体外有促进神经元轴突伸长的能力。第三部分 GelMA水凝胶生物支架促进脊髓损伤修复的研究[目的]探讨GelMA支架促进活体脊髓损伤修复的可行性。[方法]建立大鼠脊髓损伤模型,分为Gelatin和GelMA纤维支架和对照组。通过BBB运动评价量进行大鼠术后下肢运动功能的评价。在术后12周取脊髓进行组织切片及免疫组化染色(包括神经干细胞染色,神经元染色,神经轴突染色,胶质疤痕染色,星形胶质细胞染色,血管内皮细胞染色。观察神经修复、血管形成情况。[结果]通过评价下肢功能恢复情况可以判断支架修复脊髓的效果。术后第1、2、3、4、6、8、10、12周使用BBB量表进行大鼠后肢运动功能评价。结果显示,术后对照组和Gelatin组大鼠下肢自主运动功能恢复较慢且有限,GelMA组大鼠恢复较好。随着治疗时间的延长,GelMA组的治疗效果与另外两组相比,越来越好,当达到12周时GelMA组评分达到12.4±1.67,相对于空白组6.6±1.52和Gelatin组8±1.23有显著性差异(p<0.05)。本研究中脊髓神经再生观测指标包括神经干细胞、神经元以及神经突触。Nestin染色结果显示在损伤后12周仍能在损伤部位观察到神经干细胞的存在,通过光密度定量测定发现GelMA组脊髓中神经干细胞明显多于Gelatin组和空白对照组(p<0.05),证明GelMA支架更适宜周围NSCs向支架内迁移并生存。而神经元是脊髓功能恢复的细胞基础,同样,Tuj-1标记的由NSCs分化的神经元在GelMA支架内于其Gelatin支架和对照组相比显著性增高(p<0.05)。神经突触免疫组化的定性和定量结果显示,GelMA支架组的synaptophysin阳性信号明显高于Gelatin组和空白对照组(p<0.05),证明GelMA支架内有更多的突轴形成。星形胶质细胞和胶质疤痕的染色结果显示,Gelatin组和空白对照组有大量的胶质细胞增生和胶质疤痕形成,而GelMA组明显少(p<0.05)。通过对比12周后CD31标记的血管内皮细胞的图片,GelMA组比另外两组有着更多的荧光,定量结果显示差异有统计学意义(p<0.05)。[结论]用电纺水凝胶纤维构建的软仿生支架,不仅促进了神经干细胞的迁移,诱导其分化为神经元,而且抑制了其向胶质细胞分化,减少胶质瘢痕的形成,同时促进了血管生成。此外,该支架具有较高的弹性,可以在缺少骨性椎管保护的情况下抵抗变形。仿生的水凝胶微纤维在促进活体脊髓功能再生方面被证明是有效的。