论文部分内容阅读
目的:应用双基因表达的Ad-luc-hTRAIL载体,以荧光素酶作为报告基因,体外监测hTRAIL基因的表达,通过检测荧光素酶的表达,反映hTRAIL基因治疗肺癌A549细胞的疗效。方法:1腺病毒感染效力测定:Ad-EGFP以不同感染复数(MOI)感染A549细胞,培养48小时后,在荧光显微镜下观测并计数EGFP表达阳性的细胞,以此来评价腺病毒的感染效率。2 hTRAIL蛋白表达的检测:Ad-luc-hTRAIL以不同的感染复数感染A549细胞,培养48小时后,收集细胞,并对细胞进行荧光标记,然后应用流式细胞仪检测hTRAIL蛋白的表达情况。3生长抑制测定:以不同感染复数的Ad-luc-hTRAIL感染A549细胞,培养48小时后,应用四唑盐比色实验(MTT)检测转导入治疗基因后肿瘤细胞的生存率。4流式细胞仪检测hTRAIL引起的细胞凋亡:以不同感染复数的Ad-luc-hTRAIL感染A549细胞,培养48小时后,收集细胞,应用Annexin V/PI凋亡试剂盒标记细胞,流式细胞仪上机检测A549细胞的凋亡率。5液闪计数仪检测luc基因的表达5.1测定ad-luc-hTRAIL感染A549细胞后荧光素酶活性:Ad-luc-hTRAIL以不同的感染复数感染A549细胞,培养48小时后,用细胞裂解缓冲液裂解存活细胞,经高速离心后取上清,加入含荧光素的检测试剂后,应用液闪计数仪检测荧光素酶发光的液闪计数。5.2测定ad-luc感染A549细胞后荧光素酶活性:应用Ad-luc以不同的感染复数感染A549细胞,培养48小时后,用细胞裂解缓冲液裂解存活细胞,经高速离心后取上清,加入含荧光素检测试剂后,应用液闪计数仪检测荧光素酶发光的液闪计数。结果:1腺病毒感染力测定:Ad-EGFP转染A549细胞48小时后,荧光逐渐达到最强,可观测到的最低感染复数为0.1 MOI,随着MOI增大,染色阳性率逐渐增加,MOI=100时,阳性率达99.5%,说明运用腺病毒载体可有效将目的基因转导入A549细胞中。2在以不同MOI的Ad-luc-hTRAIL感染A549细胞48小时后,MTT结果显示与对照相比各组细胞生长受到明显抑制(p<0.01),随着MOI增大,细胞生存能力逐渐降低。3流式细胞术分析发现,Ad-luc-hTRAIL感染A549细胞48小时后,细胞膜上可检测到hTRAIL的表达,且随着MOI增大,hTRAIL的表达逐渐增多;Ad-luc-hTRAIL以不同MOI感染A549细胞后,均可检测到明显的细胞凋亡(p<0.01),随着MOI增大,细胞凋亡率呈上升趋势;hTRAIL的表达和A549细胞的凋亡率之间存在相关关系,且为正相关(r=0.9939, p<0.01)。4液闪计数仪测定不同MOI(10, 20, 40, 60, 80, 100)的Ad-luc-hTRAIL感染A549细胞48小时后每组样品的cpm值,结果发现在以MOI≤20的Ad-luc-hTRAIL感染的细胞样品中,cpm值随MOI增大而逐渐增高,在MOI≥20的样品中,测得的cpm值随MOI增大而逐渐减小,推断是由于hTRAIL诱导的细胞凋亡作用增强的结果,即在高MOI时,荧光素酶的液闪计数较好反应hTRAIL基因的治疗作用。结论:1应用双基因表达的Ad-luc-hTRAIL载体可有效将目的基因转导入A549细胞中,并成功表达独立的hTRAIL蛋白和荧光素酶。2腺病毒载体介导的hTRAIL基因表达对肺癌A549细胞具有显著的生长抑制和促凋亡作用。3以不同剂量的Ad-luc-hTRAIL感染A549细胞,荧光素酶的表达可实时监测hTRAIL基因的表达,也可有效监测hTRAIL基因治疗的疗效。